大鼠蛛网膜下腔出血后兴奋性氨基酸对脑微循环的影响*

高建亮，刘振刚，孙林林，付爱军，李建民，庬智寅，张中原，田景瑞

[1.华北理工大学附属医院 神经外科，河北 唐山 063000；2.河北省遵化市人民医院 神经外科,河北 遵化 064200；3.华北理工大学 基础医学院（河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 063000）]

大鼠蛛网膜下腔出血后兴奋性氨基酸对脑微循环的影响*

高建亮1，刘振刚1，孙林林1，付爱军1，李建民1，庬智寅1，张中原2，田景瑞3

[1.华北理工大学附属医院 神经外科，河北 唐山 063000；2.河北省遵化市人民医院 神经外科,河北 遵化 064200；3.华北理工大学 基础医学院（河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 063000）]

目的 探讨蛛网膜下腔出血后氧化应激链中兴奋性氨基酸对脑微循环的影响。方法 颈内血管穿刺法制作大鼠蛛网膜下腔出血模型。实验共分3组，出血模型3天组与急性期组（对照）。其中，出血后3天组又分2组，一组大鼠确定海马CA3区，另一组确定侧脑室区，分别采用微量进样器直接注射兴奋性氨基酸类似物海人酸（KA）与肾上腺髓质素（ADM），激光多普勒监测，观察并对比三者脑表面局部血流灌注量的变化趋势。结果ADM能提高SAH后脑表面局部微循环血流灌注量，KA能、降低其脑表面局部微循环血流灌注量。结论SAH后产生的氧化应激链中兴奋性氨基酸能够显著降低脑表面局部微循环血流灌注量。

激光多普勒；兴奋性氨基酸；肾上腺髓质素；海人酸

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后颅内兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）所起的作用及机制，一直是临床研究者所关注的重点之一。EAA一般是指具有2个羧基与1个氨基的酸性游离氨基酸，主要包括谷氨酸（glutamic acid，Glu）、天门冬氨酸（aspartic acid，Asp），尤其谷氨酸是中枢神经系统含量最高、分布最广、作用最强的兴奋性神经递质[1]；研究表明，SAH后EAA的毒性作用是导致患者病情恶化的主要原因之一，然而其产生及作用机制目前仍不十分清楚；近年来随着技术的进步，通过对蛛网膜下腔出血后EAA的产生、代谢与微病理变化间的关系进行大量的基础与临床研究，认为EAA能对脑微循环的灌注产生毒性作用，进而使疾病恶化[2]。肾上腺髓质素（adrenal medulla，ADM）是KITAMURE等从人的嗜铬细胞瘤组织中分离出的由52个氨基酸残基组成的活性多肽（prepro-ADM 95～146），其广泛分布于脑、肾上腺髓质等组织内，由cAMP/PKA和L-精氨酸-NO合酶/NO途径共同介导产生具有强大舒张血管及调控细胞增殖的生物学效应[3]；本实验采用大鼠颈内血管穿刺法人为制作蛛网膜下腔出血模型后注射海人酸（kainic acid，KA），其是谷氨酸的结构类似物，并通过向侧脑室注射肾上腺髓质素（adrenomedullin，ADM）[4]，激光多普勒探测脑表面微循环灌注量的变化，观察两者注射前后脑表面微循环灌注量的变化趋势，与急性期蛛网膜下腔出血大鼠脑表面微循环灌注量的变化做比较，了解其在SAH后可能产生的影响。

1 材料与方法

1.1 器械及药品

1.1.1 器械 莱卡（Leica）手术显微镜、高精度游标卡尺、剃毛器、大鼠颅骨钻、显微外科手术器械、大鼠手术体温控制台、大鼠立体定向仪、大鼠手术固定台、微量进样泵、微量进样器（100μl）、ADM、KA。

1.1.2 材料 纤芯、无菌纱布块、棉棒、自配10%水合氯醛、2%葡萄糖酸氯已定醇皮肤消毒液、3-0缝合线、1/2弧度头皮缝合针。见图1。

图1 部分实验材料

1.1.3 实验动物 清洁级SD雄性大鼠30只，体重在320～350 g，均购于中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心[SCXK-（军）2014-0001]。西安富康空气净化设备有限公司购置的动物恒温饲养柜饲养，温度控制在23～25℃，相对湿度55%～60%。以国家标准啮齿类动物固体饲料饲养，自由饮食饮水，术前禁食12 h，不禁水。无菌手术在华北理工大学屏障环境动物实验中心进行[SYXK（冀）2015-0038]。

1.2 颈内血管穿刺法复制大鼠蛛网膜下腔出血模型

1.2.1 术前处理 激光多普勒测定仪预热20 min，激光探头检测模块时间常数设置为0.03；大鼠称重，按0.3～0.4 ml/100 g体重剂量10%水合氯醛腹腔内麻醉，用力掐其脚掌等肢体无明显反应示麻醉成功。见图2。

图2 激光多普勒测定仪设置与固定

1.2.2 模型复制 大鼠仰卧位固定于手术台，沿颈部正中线偏右侧做斜切口，剪开皮肤及皮下组织，分离颈总动脉鞘，在颈外动脉与甲状腺上动脉连接根部穿双线（5-0号线），结扎颈外动脉，剪断颈外动脉，左手通过牵引线提起颈外动脉近心端残端，用神经外科显微镊细心分离颈外动脉第一分支枕动脉，结扎枕动脉，剪断枕动脉，充分分离颈外动脉残端、颈内动脉及颈总动脉分杈处血管外膜周围附着的纤维结缔组织，仔细分离颈动脉窦及颈动脉小球，先用动脉夹夹闭颈总动脉近心端，再用另一个动脉夹夹闭颈内动脉远心端，轻轻提起颈外动脉，用神经外科显微剪在颈外动脉近分叉处、枕动脉残端对侧剪一小口，导入纤芯，牵拉颈外动脉，使其与颈内动脉近似呈一直线（纤芯尾部与颈部正中线呈30～45°、与水平面也呈30～45°，纤芯头部向内侧），由颈外开口插入颈内动脉至动脉夹处，松开颈内动脉动脉夹，快速插入纤芯，插入约20 mm[5]，此时有畅通无阻力感，再次快速插入纤芯1～2 mm，快速抽出纤芯，提起颈外动脉，在颈外动脉剪口的近心端再次结扎颈外动脉，打开颈总动脉动脉夹，观察颈总动脉、颈内动脉的血流、搏动情况及大鼠的瞳孔以及大小便，血管充盈、搏动良好，出现双侧瞳孔不等大、针尖样大小及大小便失禁等，证明造模成功。急性期组用无菌纱布块包裹颈部伤口，改俯卧位，出血3天组大鼠直接取俯卧位，大鼠立体定向仪固定大鼠头部，打开Leica手术显微镜及大鼠手术体温控制仪，温度检测传感器探头插入大鼠肛门内，小心将微量进样器固定于大鼠立体定向仪上，手术区域大小范围为3 cm×2 cm，手术区消毒3次；手术刀沿纵轴线切开大鼠头皮全层，暴露颅骨骨膜，用钻头在颅骨额、顶部打孔，本次实验采用双侧打孔（见图3），可以打一圈小孔用神经显微镊轻翘颅骨或用线锯去除探测区颅骨，在显微镜下脑膜剪剪除探测区硬脑膜，安装并固定好激光监测探头（见图2）。分别定位前囱（Bregma）点与后囱人字点（lambda），通过与前囱点（Bregma）的中间横向距离（medial lateral，ML）、背腹距离（dorsal ventral，DV）及前后距离（anterior posterior,AP）测量。急性期组直接进行持续连续监测。出血3天组中一组大鼠侧脑室定位（Bregma点为基点，AP 0.84 mm、ML 1.6 mm、DV 3.6 mm）给予ADM注射；另一组大鼠海马CA3区（Bregma点为基点，AP 4.68 mm、ML 4.20 mm、DV 4.20 mm）给予KA注射[6]，观察注射前后波形变化，并进行3组比较分析。

1.2 实验动物与分组

3组大鼠采用颈内血管穿刺法人为制作蛛网膜下腔出血（见图4）。大鼠分3组，每组10只，皆为颈内动脉穿刺蛛网膜下腔出血成功模型，颅骨开窗；出血3天中一组肾上腺髓质素组。采用直接侧脑室注射ADM（浓度1 μg/μl，按每只大鼠10 μg/100g，300～350 g大鼠注射量为30～35μl）[7]；另一组海人酸组。采用直接海马CA3区注射KA（浓度为1 μg/ μl，按每只大鼠10 μg/100 g，300～350 g大鼠注射量为30～35 μl）[7]；急性期组（对照）采用直接监测。

图3 模型鼠双侧打孔

图4 模型鼠解剖示意图

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，数据用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

EAA类似物（海人酸KA）与肾上腺髓质素（ADM）都对脑表面微循环产生的影响。ADM能够改善脑表面微循环的灌注量（见附表和图5），KA相反（见附表和图6）；KA与ADM组、SAH急性期组（见附表和图7）比较，从开始注射到注射完毕后延迟的某段时间内能够降低脑表面微循环的灌注量，且对本时间段内脑表面微循环灌注量（平均值）的减少量进行比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图8。

激光探头监测大鼠蛛网膜下腔出血3 d后脑表面微循环灌注量在6灌注量（PU）左右/单位时间，ADM与KA以相同剂量（浓度1 μg/μl，按每只大鼠为10 μg/100 g，注射剂量为30 μl）注射，ADM可使SAH后3 d大鼠脑表面微循环灌注量在单位时间、单位面积内平均值增加至（14.21±0.97）PU，而KA使大鼠脑表面微循环灌注量在单位时间、单位面积内平均值减小至（2.83±0.83）PU，当颈内穿刺法制作蛛网膜下腔出血模型后急性期监测大鼠脑表面微循环灌注量在单位时间、单位面积内平均值减小至（2.10±0.24）PU。SAH后KA注射组降低脑表面微循环灌注量（F=820.748，P=0.000）。

附表 大鼠监测结果的描述比较

图5 ADM即肾上腺髓质素组

图6 KA即海人酸组

图7 SAH造模成功急性期组

图8 3组大鼠脑表面微循环灌注量（平均值）（±s）

3 讨论

研究结果显示，SAH后EAA在蛛网膜下腔出血后氧化应激链中降低脑表面微循环灌注量。现有研究认为，当机体受到动脉瘤突然破裂致蛛网膜下腔出血等创伤时，产生强烈的应激反应，甲状腺激素与胰岛素分泌不足或出现组织抵抗，细胞内腺嘌呤核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）依赖的蛋白激酶 [adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]能量代谢通路受抑制，骨骼肌细胞利用血糖障碍，肝糖原输出增多，血液中血糖急速升高等致脑组织内乳酸大量生成，星形胶质细胞特异性表达的谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）功能蛋白丢失或活性降低以及谷氨酸转运体的功能发生紊乱，谷氨酸代谢异常增高，清除能力下降，谷氨酸在脑细胞外大量堆积，其诱导离子型受体（iGluRs）-大脑皮质与海马区密度最高，主要是N-甲基-D-门冬氨酸受（N-methyl-D-aspartic acid，NMDAR）、海人藻酸受体（kainate receptor，KAR）及α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic receptor，AMPAR）过度活化，受体与离子通道偶联，形成受体-离子通道复合物，介导快信号传递，使神经元及星形胶质细胞等出现快速代谢异常，致使神经元及其所处微环境出现明显供血、供养障碍；同时诱导亲代谢型受体（mGluRs）即L-2-氨基-4磷酰丁酸受体，与膜内G蛋白偶联，这些受体被激活后通过G蛋白效应酶、脑内第二信使等组成的信号转导系统起作用，产生较缓慢的生理反应进而通过一系列的神经化学变化加重脑组织缺血、缺氧，激活星形胶质细胞肥大、增生[8]；EAA可通过以下两种机制引起神经细胞功能的损害。①SAH后早期脑组织EAA（lGu、lAa）增高，激活KAR-海马CA3区密度较高，使Na+内流，细胞内、外渗透压发生变化，导致缺血后早期细胞损害；②EAA促使NMDA受体操纵的及电位依赖的Ca2+通道开放，使细胞内Ca2+增高，出现线粒体中Ca2+超载、线粒体膜电位的去极化，将中断氧化磷酸化反应，导致ATP合成减少和自由基生成增多，同时激活磷脂酶A2、磷脂酶C、蛋白水解酶、核酸内切酶及一些中性蛋白酶等，加速酶促反应，促进细胞膜溶解崩溃，星形胶质细胞代谢异常，神经元及其所处微环境缺血、缺氧，诱发神经元细胞内DNA断裂和修复障碍，从而引起迟发性神经细胞的损害，对机体产生的毒性作用[9-10]；本实验可证实，EAA能直接影响SAH后大脑微循环可能是其毒性作用之一。本实验结果表明：①大鼠钻颅前，一定要用力把颅骨膜用棉棒擦拭到两边，不然钻孔时，会把骨膜绞入钻头，出现不必要的伤害或危险，必要时把两侧颞肌进行少许分离；②钻孔时，一定要小心仔细，钻头尽量与颅骨垂直，不要用力下压钻头，避免钻头突然钻透颅骨而刺破脑组织表面较粗动静脉，产生出血或对脑组织产生伤害；③钻孔要避开静脉窦；④剪硬脑膜时，最好用显微外科镊轻轻夹起再剪；⑤当脑表面有较粗动静脉显露时，激光探头要避开血管，因血管膜较厚，激光无法穿透，影响数据的采集和结果的判断；⑥要不时向外露脑组织滴生理盐水，防止脑组织干燥，但不可过多，以免影响结果的准确性，再则不要使脑脊液接触到激光光纤探头，以免影响激光的传输，必要时可用医用酒精擦拭，以去除油脂成份；⑦测量前一定要对模块校准。

[1] BELL J D,THOMAS T C,LASS E,et al.Platelet-mediated changes to neuronal glutamate receptor expression at sites of microthrombosis following experimental subarachnoid hemorrhage[J]. Journal of Neurosurgery,2014,121(6):1424-1431.

[2] 袁华,龙华,牟翔,等.局灶性脑缺血再灌注大鼠皮质中谷氨酸相互作用蛋白和谷氨酸受体2的表达[J].中国卒中杂志,2011,6(3): 210-214.

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[4] SANDERSON J L,GORSKI J A,DELL'ACQUA M L.NMDA receptor-dependent LTD requires transient synaptic incorporation of Ca2+-permeable AMPARs mediated by AKAP150-anchored PKA and calcineurin[J].Neuron,2016,89(5):1000-1015.

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Study of excitatory amino acid of cerebral microcirculation after SAH*

Jian-liang Gao1,Zhen-gang Liu1,Lin-lin Sun1,Ai-jun Fu1,Jian-min Li1, Zhi-yin Mang1,Zhong-yuan Zhang2,Jing-rui Tian3
(1.Department of Neurosurgery,North China University of Science and Technology Affiliated Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China;2.Department of Neurosurgery,Zunhua People's hospital,Zunhua,Hebei 064200,China;3.Basic medical college of North China University of Science and Technology(Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases,Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases), Tangshan,Hebei,063000,China)

Objective To explore the effect of excitatory amino acids on cerebral microcirculation in the chain of oxidative stress after subarachnoid hemorrhage.Methods Subarachnoid hemorrhage model was established by internal carotid vascular puncture and then divided into 3-day group and acute phase group (sham).The rats were divided into three groups.In the hemorrhage group,rats were divided into 2 groups after 3 days.The rat heads were fastened by brain stereotactic apparatus,and removed skull to open a window for the dura mater friction.Which is the bleeding 3-day group.Respectively positioning chimney bregma and posterior fontanelle lambda points,with the former chimney bregma point of medial lateral (ML)in the middle of the horizontal distance,and dorsal ventral (DV)back abdomen distance and Anterior posterior(AP) before and after the distance measurement,a set of rat hippocampal CA3 area was determined,and anothergroup of lateral ventricle region was determined.Trace samplers were used respectively to directly inject excitatory amino acid analogues kainic acid (KA)and adrenal medullary quality (ADM),with a laser doppler monitoring.The trends of brain surface local blood flow perfusion were observed and compared.Results ADM significantly increased the local microcirculation perfusion of SAH back surface,KA significantly reduced the brain surface local microcirculation perfusion.Conclusions The excitatory amino acids can significantly reduce brain surface local microcirculation perfusion in the chain of oxidatie stress after SAH.

laser doppler;excitatory amino acid;adrenomedullin;kainic acid

R743.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.006

1005-8982（2017）05-0028-05

2016-08-01

河北省级重大医学项目（No：Zd2013093）

付爱军，E-mail：tsfaj@sina.com

高建亮，现工作于河北省唐山遵化市人民医院，华北理工大学在职硕士研究生