肥厚型心肌病诱导多能干细胞模型的建立*

李然，贾倩倩，沈明，鲍礼智，郑兴

（1.第二军医大学长海医院 心血管内科，上海 200433；2.中国科学院上海生命科学研究院，上海 200031）

肥厚型心肌病诱导多能干细胞模型的建立*

李然1，贾倩倩2，沈明1，鲍礼智1，郑兴1

（1.第二军医大学长海医院 心血管内科，上海 200433；2.中国科学院上海生命科学研究院，上海 200031）

目的 拟构建肥厚型心肌病特异性诱导多能干细胞模型。方法 通过收集肥厚型心肌病患者外周血液标本，分离培养其中的单核细胞；然后，将编码Oct4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28、mp53DD和EBNA1的附加型质粒组合电转外周血单核细胞进行重编程；最后，通过形态学、AP染色、干细胞多能表面标志物免疫荧光、RT-PCR及EB自发三胚层分化潜能实验对获得的诱导多能干细胞进行检测分析。结果 诱导获得的多能干细胞显现出明显的干细胞样形态，AP染色、多能标志物检测均符合干细胞特征，与人胚胎干细胞H9相似。此外，EB自发分化实验也证实具有完全的三胚层分化发育潜力。结论 成功获得肥厚型心肌病特异性诱导多能干细胞系，为后续疾病特异性心肌分化模型的建立、疾病发生机制的研究及药物开发应用奠定基础。

肥厚型心肌病；外周血单核细胞；诱导多能干细胞；疾病模型

肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一种常见的复杂性遗传性心脏病，临床上以心室异常性肥厚而不能由其他心脏疾病或系统性疾病加以解释作为诊断依据[1-2]。本病是青少年和运动员猝死的最常见原因，少数进展为终末期心力衰竭（心衰），另有少部分出现心衰、房颤和栓塞[3]。目前认为，HCM主要由心肌肌节蛋白基因突变引起，已发现至少11个疾病基因和1 400种变异[4]。随着检查成像技术及基因检测技术进步，人们逐渐掌握该病人群发病率、病变形态学特征、患者临床表现和自然病程等规律[5-6]。然而，一直以来，一方面由于人HCM活体心肌细胞获取受限以及心肌细胞体外培养增殖较为困难；另一方面由于不同与其他疾病，HCM虽然归类于遗传性心肌病，但是患者个体间基因变异较大，而疾病机制研究需要含有患者特异性的遗传背景模型，以往传统意义上的疾病模型无法满足需求[7]，使得人们对HCM发病过程中具体的分子机制仍不完全清楚，相关的治疗措施也非常迟滞[8]。

2006年以来，由YAMANAK[9-10]开创的体细胞重编程技术有效避开胚胎干细胞相关伦理争议和免疫排斥问题，可应用于体外器官构建、体内病理修复和终末期疾病治疗，特别是遗传性疾病细胞模型构建及药物筛选等。该类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）疾病模型具有其他疾病模型无法企及的优势：保存有来源细胞特异性遗传背景、无限增殖能力和三胚层分化发育的潜能[11]。这为肥厚型心肌病研究广泛开展提供新的途径。本研究借助重编程技术，将HCM患者血液细胞重编程为iPSCs。而且，在将人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）重编程HCM-iPSCs模型过程中，采用无病毒、非整合及无饲养层细胞的诱导和培养体系，高效安全的获得iPSCs，为后续研究奠定基础。

1 资料与方法

肥厚型心肌患者血液标本源于长海医院收治的2例男性患者，根据临床症状、相关病史、心脏彩超及心导管检查等，患者被确诊为肥厚型心肌病。本研究获得长海医院伦理委员会批准（编号：CHEC2016-146），患者充分知情并签署知情同意书。

1.1 主要材料与试剂

细胞培养板（美国Corning公司），人胚胎干细胞H9（美国WiCell干细胞库），聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂盒（美国Thermo公司），Ficoll淋巴细胞分离液（美国GE公司），KBM502培养液（美国Corning公司），DMEM/F12培养液，Knockout血清替代培养物、Dispase消化酶、NEAA、bFGF、Epi5TM重编程试剂盒、Trizol试剂（美国Invitrogen公司），DPBS，E8培养液（美国Gibco公司），mTeSR1（美国Stem cell公司），Gelatin，TritonX-100，DAPI染液（美国Sigma公司），AP染色试剂盒（上海斯丹赛公司），FastQuant RT Kit（北京天根公司），Ex Tag试剂盒（日本TaKaRa株式会社），干细胞级的matrixgel（美国BD Biosciences公司），实验用引物（上海生物工程股份有限公司），抗体OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、Desmin和山羊抗兔二抗（美国CST公司），抗体TRA-1-60、Nestin、AFP-01和山羊抗小鼠二抗（英国Abcam公司）。

1.2 仪器与设备

荧光显微镜Olympus-IX71（日本奥林巴斯公司），台式离心机、恒温水浴锅、超净台、生物安全柜、PCR仪和培养箱（美国Thermo公司），Neon转染系统（美国Invitrogen公司），电泳仪（美国Major Science公司）凝胶图像分析仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 外周血单核细胞分离培养

采用密度梯度离心法分离外周血获得PBMCs。采集患者外周血3 ml，用DPBS稀释1倍后缓慢加入等体积淋巴细胞分离液，1 500转/min，减速度1，离心30min后小心吸取中间层细胞；用DPBS再次稀释洗涤；1 500转/min，离心10 min，吸弃上清液，重复洗涤1次，然后将细胞用2 ml KBM502培养液重悬，取细胞总量1/3接种到1个6孔板孔中，其余冷冻保存。细胞接种后第2天补液2 ml，第4天2 ml换液，第6天补液2 ml，第8天补液2 ml。

1.4 电转附加体方式建系

使用Invitrogen公司Epi5TM重编程试剂盒对PBMCs进行重编程。具体过程为：取体外培养PBMCs，计数1×105～2×105，1 200转/min离心5 min，吸弃上清液，DPBS稀释清洗，离心吸弃上清液，重复洗涤1次。按照说明加入含有Sox2、Klf4、Oct4、L-Myc、Lin28、mp53DD和EBNA1混合附加体及电转液并充分混匀，设置电转参数1550V，10ms，3次，10 μl体系，然后进行电转。电转完成后，将细胞接种到含有KBM502预温培养液的24孔板内（已包被matrigel）。隔夜后（记为第1天）补充培养液0.5 ml（100 ng/ml bFGF+mTeSR1培液），此后连续4d，每天补液0.5ml/孔；第6天至第8天，连续3 d每天1 ml/孔换液；第9天开始培养液更换为E8培养液，其余同前每天换液并观察克隆生长情况。

1.5 iPSCs挑选及传代培养

机械法挑传细胞。初始几代诱导多能干细胞，换液后用玻璃针（末端经烧灼成球状）将iPSCs克隆分割成小片，周边轻推使其悬浮，玻璃管吸取后接种matrigel包被的mTesR1培养液中培养。每日换液，观察去除分化细胞。细胞稳定传代后，改用dispase酶消化传代。

1.6 iPSCs多能性检测

选取人胚胎干细胞H9与肥厚型心肌病患者的外周血诱导获得的多能干细胞（HCM-iPSCs）同时铺板培养，对比分析HCM-iPSCs多能性。

1.6.1 碱性磷酸酶染色 使用斯丹赛AP染色试剂盒。具体为：细胞传代后培养2 d，吸去培养液，PBS润洗2次，然后4%PFA固定1 min；PBS洗2次，TBST润洗2次，加入染色试剂，室温避光放置15min；吸出染色液，PBS润洗1次，加适量PBS显微镜下观察以蓝/紫染色为阳性。

1.6.2 免疫荧光检测 获得iPSCs经稳定传代后，选取第10代iPSCs克隆，按照免疫荧光常规步骤，经PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100通透，5%山羊血清封闭，一抗4℃过夜孵育，孵育二抗，最后DAPI染色后用荧光显微镜观察并拍照。

1.6.3 拟胚体（embryoid body，EB）自发分化 选取第10代HCM-iPSCs克隆用Dispase消化后接种到低黏附培养板，先用mTeSR1培养液悬浮培养2 d，然后改用EB培养液（20%KSR+DMEM/FF12+2 mmol/L L-Glu+0.1 mol/L NEAA）悬浮培养，8 d后将悬浮EB接种到明胶包被的培养板内继续培养8 d，培养期间均是每2 d换液1次。最后，将部分实验细胞进细胞固定、通透、封闭，分别孵育内胚层AFP-01、中胚层Desmin和外胚层Nestin标记抗体，孵育二抗，DAPI染色后荧光显微镜下观察；部分分化细胞抽提RNA，逆转录PCR扩增后与H9和PBMCs进行电泳对比分析。

1.6.4 RT-PCR Trizol法抽提RNA。H9、PBMCs 和iPSCs经Trizol裂解，氯仿分离抽提，异丙醇沉淀，75%酒精漂洗，DEPC水稀释后计量分装。cDNA按照天根公司Fast Quant RT Kit操作说明逆转录获得。PCR反应按照TaKaRa Ex Tag试剂盒说明书进行操作，引物来源参考文献[12]。

1.6.5 凝胶电泳 常规制备0.8%琼脂糖凝胶液，取10 μl DNA样品与上样液混匀后上样，电压5 V/cm，电泳结束后进行成像分析。

2 结果

2.1 HCM患者PBMCs的原代培养细胞

培养HCM外周血分离得到的PBMCs，细胞生长活跃，数量大量增加，培养1周左右显微镜下观察见大量簇状细胞克隆。见图1。

图1HCM-PBMCs扩增与培养

2.2 HCM患者PBMCs重编程

电转后培养初期，细胞增殖缓慢，部分细胞形态发生改变，数量增加。第12天显微镜下见形态明显变化的细胞克隆，随后细胞快速增殖，聚集密度逐渐增大，克隆也不断扩大。第21天挑传细胞继续培养。多次传代后仍保持干细胞样形态。见图2。

2.3 HCM患者特异性iPSCs多能性检测结果

HCM-iPSCs碱性磷酸酶染色、干细胞多能性标记抗体OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4及TRA-1-60染色结果呈阳性；与DAPI共染图像显示出良好细胞形态；iPSCs半定量PCR电泳条带显示，iPSCs多次传代后仍具有与对照组H9相似表达谱，外周血单核细胞则未见表达。见图3。

2.4 HCM患者血液源性iPSCs的分化发育潜能检验结果

HCM-iPSCs自发分化实验，免疫荧光检测显示内胚层、中胚层和外胚层标记物染色呈阳性；多次传代后，HCM-iPSCs自发分化实验，PCR凝胶电泳显示分化细胞有相关三胚层基因表达，对照组未见表达。见图4。

图2HCM患者PBMCs重编程

图3HCM-iPSCs多能性检测结果

图4HCM-iPSCs自发分化实验

3 讨论

肥厚型心肌病基础研究进展缓慢。有关HCM文献描述，最早可追溯到19世纪70年代HALLOPEAU等人在《Gazette Medecine Paris》杂志上对该类患者的报道，距今已有150多年的历史。目前，HCM研究已有很大发展，越来越多的基因突变位点被发现报道。但是总体上，HCM研究取得的进展仍多局限于临床研究，如心电图影像学等研究[13]。HCM疾病模型构建困难，是相关基础研究进展迟滞的重要原因。

本研究借助电转技术，将编码重编程转录因子的附加体质粒组合导入外周血细胞进行重编程，并经鉴定成功获得2例患者特异性PBMCs-iPSCs。虽然，研究人员借助HCM模型小鼠在一些机制研究中也取得很多成果[14-17]，但是模型动物和人体细胞代谢等很多方面存在较大差异。与之相比，iPSCs来源患者体细胞，携带患者全部基因，可短时大量扩增，有望解决HCM患者活体心肌细胞采集困难，无法扩增，不能满足研究大量需求等问题，具有很好的研究应用前景[18]。

为避免初始淋巴细胞基因重排的影响，按照DOWEY等[19]报道方法，实验中没有将PBMCs分离后直接电转附加体进行重编程，而是在体外培养8～ 14 d后，再进行电转诱导获得HCM-iPSCs。而且，在HCM患者iPSCs建立过程中，和LIU等[20]已有报道不同，本研究简化电转后诱导培养过程。电转后，培养早期（前8 d）使用mTesR1添加bFGF培养液（100 ng/ml），后期使用E8培养液，同样成功获得iPSCs，简化培液种类，降低费用消耗，更利于研究广泛开展。此外，尽管HAN等[21]报道利用逆转录病毒将经典重编程转录因子导入患者皮肤成纤维细胞，诱导也获得HCM-iPSCs。但是，HAN等研究的皮肤取样涉及麻醉、缝合及后期拆线，对患者身体创伤较大。而且，HAN使用病毒载体导入转录因子的方式有基因插入的风险。相对而言，本研究采用人外周血作为初始细胞，标本容易获得，取材方便，常规静脉穿刺就可得到大量的外周血细胞，可大大缩短初始细胞制备时间，较Han方法在HCM-iPSCs建立上更具优势。总之，通过采集肥厚型心肌病患者少量外周血细胞，并从中分离培养单核细胞，应用电转非整合附加体方式，成功获得2例HCM患者的iPSCs。HCM-iPSCs可用于定向诱导分化为心肌细胞建立肥厚型心肌病特异心肌细胞模型，这为缺乏合适疾病研究模型找到解决办法，对后续疾病机制的深入研究具有重要的现实意义。

参考文献：

[1] SEN-CHOWDHRY S,JACOBY D,MOON J C,et al.Update on hypertrophic cardiomyopathy and a guide to the guidelines[J]. Nature Reviews Cardiology,2016,13(11):651-675.

[2] ELLIOTT P M,ANASTASAKIS A,BORGER M A,et al.2014 ESC guidelines on diagnosis and management of hypertrophic cardiomyopathy:the task force for the diagnosis and management of hypertrophic cardiomyopathy of the european society of cardiology(ESC)[J].European Heart Journal,2014,35(39):2733-2779. [3]MARON B J,ROWIN E J,CASEY S A,et al.Hypertrophic cardiomyopathy in children,adolescents,and young adults associated with low cardiovascular mortality with contemporary management strategies[J].Circulation,2016,133(1):62-73.

[4] MARON B J,MARON M S.Hypertrophic cardiomyopathy[J]. Lancet,2013,381(9862):242-255.

[5] MARON B J,MARON M S.A discussionofcontemporary nomenclature,diagnosis,imaging,and managementofpatients with hypertrophic cardiomyopathy[J].The American Journal of Cardiology,2016,118(12):1897.

[6] MARON B J,MARON M S.The 20 advances that have defined contemporary hypertrophic cardiomyopathy[J].Trends Cardiovasc Med,2015,25(1):54-64.

[7] FAIELLA W,ATOUI R.Therapeutic use of stem cells for cardiovascular disease[J].Clinical and Translational Medicine,2016, 5(1):34.

[8] KEMPF H,ANDREE B,ZWEIGERDT R.Large-scale production of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2016,96:18-30.

[9] TAKAHASHI K,YAMANAKA S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[10] TAKAHASHI K,TANABE K,OHNUKI M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

[11] AVIOR Y,SAGI I,BENVENISTY N.Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2016,17(3):170-182.

[12] YU J,VODYANIK M A,SMUGA-OTTO K,et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells[J]. Science,2007,318(5858):1917-1920.

[13] 王翠荣.肥厚型心肌病的心电图特点[J].中国现代医学杂志,2004, 14(10):136-137.

[14] TEEKAKIRIKUL P,EMINAGA S,TOKA O,et al.Cardiac fibrosis in mice with hypertrophic cardiomyopathy is mediated by non-myocyte proliferation and requires Tgf-beta[J].J Clin Invest,2010,120(10):3520-3529.

[15] BLANKENBURG R,HACKERTK,WURSTER S,etal. β-Myosin heavy chain variant Val 606 Met causes very mild hypertrophic cardiomyopathy in mice,butexacerbates HCM phenotypes in mice carrying other HCM mutations[J].Circulation Research,2014,115(2):227-237.

[16] 董伟,冯娟,全雄志,等.cTnT～（R92Q）转基因小鼠肥厚型心肌病模型的建立[J].中国比较医学杂志,2008(5):5-8.

[17] 朱春霞.扩张型、肥厚型心肌病心肌重塑的蛋白质及信号通路研究[D].南京：南京医科大学,2006.

[18] SAYED N,LIU C,WU J C.Translation of human-induced pluripotent stem cells:from clinical trial in a dish to precision medicine[J].Journal of the American College ofCardiology, 2016,67(18):2161-2176.

[19] DOWEY S N,HUANG X,CHOU B K,et al.Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression[J]. Nature Protocol,2012,7(11):2013-2021.

[20] LIU J,BRZESZCZYNSKA J,SAMUEL K,et al.Efficient episomal reprogramming of blood mononuclear cells and differentiation to hepatocytes with functional drug metabolism[J].Experimental Cell Research,2015,338(2):203-213.

[21] HAN L,LI Y,TCHAO J,et al.Study familial hypertrophic cardiomyopathy using patient-specific induced pluripotent stem cells[J].Cardiovascular Research,2014,104(2):258-269.

Establishment of induced pluripotent stem cell model of hypertrophic cardiomyopathy*

Ran Li1,Qian-qian Jia2,Ming Shen1,Li-zhi Bao1,Xing Zheng1
(1.Department of Cardiovasology,Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai,200433,China;2.Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences,Shanghai,200031,China)

Objective To establish patient-specific induced pluripotent stem cell model of hypertrophic cardiomyopathy(HCM).Methods Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were isolated and cultured from whole blood of patients with HCM.And then,episomal combinations coding Sox2,Klf4,Oct4,L-Myc,Lin28, mp53DD,EBNA1 were electroporated into PBMCs.Pluripotency and stability of the induced pluripotent stem cells (iPSCs)were tested by standard procedures including cell morphology,alkaline phosphatase staining, pluripotency markers staining,and potential differentiation of all three germ layers was detected through embryonic body (EB)formation test.Results The patient-specific iPSCs possessed the characteristic of human embryonic stem cells (ESC),confirmed by methods including clearly ESC-like colonies,alkaline phosphatase staining,immunofluorescence and RT-PCR for expression of pluripotency markers,which were similar to human ESC H9.Additionally,EB formation test demonstrated that iPSCs hold potential to differentiate into all three germ layers.Conclusions Hypertrophic cardiomyopathy patient-specific iPSCs are successfully obtained, which lays the foundation of further construction of induced cardiomyocytes HCM disease model,mechanism study and drug discovery.

hypertrophic cardiomyopathy;peripheral blood mononuclear cells;induced pluripotent stem cells;disease model

R542.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.001

1005-8982（2017）05-0001-06

2016-12-15

国家自然科学基金（No：81170092）

郑兴，E-mail：zhengxing57530@163.com；Tel：021-311161262