掺锶聚磷酸钙骨修复材料对成骨细胞血管内皮生长因子蛋白分泌量的影响

俞雷钧

（浙江省立同德医院骨伤科，浙江杭州 310012）

掺锶聚磷酸钙骨修复材料对成骨细胞血管内皮生长因子蛋白分泌量的影响

俞雷钧

（浙江省立同德医院骨伤科，浙江杭州 310012）

目的探讨掺锶聚磷酸钙骨修复材料对成骨细胞血管内皮生长因子（VEGF）蛋白分泌量的影响。方法制备不同含锶量的掺锶聚磷酸钙骨修复材料，采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定成骨细胞的VEGF蛋白分泌量，并采用噻唑蓝(MTT)法考察其对成骨细胞增殖的影响。结果ELISA法结果表明，培养7 d后，1%，3%，5%，8%，10%含锶量的掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞VEGF分泌量均高于聚磷酸钙，差异均有统计学意义(t＝6.561，11.454，11.256，15.149，9.778，P＜0.05)，其中，8%含锶量掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞VEGF分泌量最高。MTT法结果表明，培养3，5，7，9 d后，8%掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙浸提液作用的成骨细胞的吸光度（A）值高于阴性对照，差异均有统计学意义(t＝3.960，5.029，5.229，4.808，2.584，2.954，2.657，2.798，P＜0.05)；培养5，7，9 d后，8%掺锶聚磷酸钙浸提液作用的成骨细胞的A值高于聚磷酸钙，差异均有统计学意义(t＝2.583，2.930，1.934，P＜0.05)。结论掺锶聚磷酸钙作为一种新型的骨修复材料，能促进成骨细胞分泌VEGF，具有良好的临床应用前景。

掺锶聚磷酸钙；骨修复材料；成骨细胞；血管内皮生长因子

生物组织工程材料植入体内后，促进血管的形成过程复杂而缓慢，因而将大尺寸骨修复材料植入体内后，周围血管组织的血管化过程已成为研究热点。关键是骨修复材料是否能促进成骨细胞或周围细胞大量分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，加速周围血管组织的血管化过程[1－3]。VEGF在生理与病理条件下能促进血管形成和生长，作用机制主要是加速血管内皮细胞的有丝分裂过程[4]。掺锶聚磷酸钙是一种新型的骨修复材料，有良好的骨源性、生物相容性和生物降解性，植入人体后的安全性良好[5－7]。本研究中，考察了不同含锶量的掺锶聚磷酸钙骨修复材料对成骨细胞VEGF蛋白分泌量的影响，旨在为骨科临床提供新的骨修复材料。

1 材料与方法

1.1 细胞、仪器与试剂

细胞：大鼠ROS 17／2.8成骨细胞株，购于四川大学华西医院移植工程与移植免疫实验室。

仪器：AG－10TA型电子万能试验机（日本岛津公司）；MCO－18AIC型二氧化碳恒温培养箱（日本三洋公司）；BIO－RAD608型酶标仪（美国BioRad公司）；IX2－SL型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。

试剂：碳酸锶（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号为1405231）；碳酸钙（分析纯，国药化学试剂有限公司，批号为150117）；聚乙烯醇（分析纯，重庆北碚精细化工厂）；DMEM培养基、胰酶（美国GIBCO公司）；胎牛血清（北京圣马元亨生物制品研究所）；噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司）；酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒（美国R＆D Systems公司）；二甲亚砜、硬脂酸、磷酸、无水乙醇均为分析纯(国药化学试剂有限公司)。

1.2 制备方法

按照一定摩尔百分比的锶／钙分别称取碳酸锶和碳酸钙，加入磷酸溶液中反应生成相应的磷酸二氢盐，室温至少放置12 h，用无水乙醇去除剩余的磷酸直至pH为6。将上述混合盐，置坩埚内500℃恒温下煅烧12 h，再采用15℃／min的速率逐渐升温至1 200℃，此时混合盐熔融，保温1 h，淬火得掺锶聚磷酸钙无定型烧料。研磨无定型烧料，过200目筛，另取过60目筛硬脂酸作为致孔剂，聚乙烯醇作为黏合剂，与掺锶聚磷酸钙粉末充分混合，压制成高2 mm、直径10 mm的胚，800℃恒温下持续烧制3 h，得掺锶聚磷酸钙多孔支架。

1.3 VEGF 蛋白量测定

成骨细胞VEGF蛋白分泌量的测定采用ELISA法[8]。将成骨细胞与不同掺锶量的掺锶聚磷酸钙多孔支架和不加锶的聚磷酸钙的复合恒温37℃培养至细胞汇合（n＝8），在培养基中加入1，25－(OH)2VD3，使终浓度为10－7mmol／L，再恒温37℃培养7 d后离心，取得上清液，遵照ELISA试剂盒的说明书测定上清液中的VEGF蛋白量。

1.4 成骨细胞增殖影响试验

将掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙在121℃下高压灭菌20 min，按培养液与试样表面积之比为100 L／m2，无菌浸提72 h制作材料浸提液。在96孔板的孔中加入100 μL成骨细胞悬液与100 μL材料浸提液，成骨细胞接种浓度为4×107／L；阴性对照孔则仅加入200 μL培养液（n＝8）；37℃恒温培养。分别在培养1，3，5，7，9 d后加入20 μL MTT，并继续培养4 h，再吸出孔中的培养液，每孔加二甲亚砜150 μL，置振荡器上振荡15 min，然后采用酶标仪测定各个孔在570 nm波长处的吸光度（A），得成骨细胞的增殖情况。

1.5 统计学处理

应用SPSS 22.0统计学软件处理数据。计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用t检验。检验水准为α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对成骨细胞VEGF 分泌量的影响

ELISA法结果表明，培养7 d后，1%，3%，5%，8%，10%含锶量的掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞VEGF分泌量均高于聚磷酸钙(t＝6.561，11.454，11.256，15.149，9.778，P＜0.05)，其中8%含锶量掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞VEGF分泌量最高。结果见图1和表1。

图1 不同含锶量掺锶聚磷酸钙对成骨细胞分泌VEGF的影响

表1 不同含锶量掺锶聚磷酸钙对成骨细胞分泌VEGF的影响(±s，n＝8)

表1 不同含锶量掺锶聚磷酸钙对成骨细胞分泌VEGF的影响(±s，n＝8)

2.2 对成骨细胞增殖的影响

MTT法结果表明，培养3，5，7，9 d后，8%掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙浸提液作用的成骨细胞的A值均高于阴性对照(t＝3.960，5.029，5.229，4.808，2.584，2.954，2.657，2.798，P＜0.05)；培养5，7，9 d后，8%掺锶聚磷酸钙浸提液作用的成骨细胞的A值高于聚磷酸钙(t＝2.583，2.930，1.934，P＜0.05)。结果见表2和图2。

表2 不同材料对成骨细胞增殖的影响(±s，n＝8)

表2 不同材料对成骨细胞增殖的影响(±s，n＝8)

注：与阴性对照比较，aP＜0.05；与聚磷酸钙比较，bP＜0.05。

材料A值8%掺锶聚磷酸钙聚磷酸钙阴性对照1 d 0.21±0.09 0.25±0.10 0.23±0.07 3 d 0.52±0.12a0.42±0.08a0.31±0.09 5 d 0.71±0.17ab0.52±0.12a0.35±0.11 7 d 0.97±0.18ab0.74±0.13a0.58±0.11 9 d 0.94±0.16ab0.79±0.15a0.60±0.12

图2 不同材料对成骨细胞增殖的影响

3 讨论

锶是人体中重要的微量元素，主要存在于骨骼与牙齿内，而其中的99%均蓄积在骨骼，其质量约占骨总质量的万分之一。锶元素在体内可有效降低破骨细胞来源并抑制其活性，从而抑制骨吸收；可促进成骨细胞增殖，加速其分化过程，从而促进成骨。但锶的以上作用与其浓度有关，应在局部达到有效浓度，锶元素才能充分发挥加速成骨细胞增殖及抑制骨吸收的生物活性，从而加速受损骨组织的修复，有效提高骨骼的强度与韧性。

血管生成及再生在骨组织伤口的愈合过程中尤为重要，一定程度上决定了患者的预后[9]。骨科手术需要植入生物材料与组织工程移植物，聚磷酸钙是非常重要的组织工程材料，具有良好的生物相容性[10－12]。植入组织工程材料后的局部血管形成过程十分缓慢，想达到大尺寸移植物及血管组织的有效血管化较为困难。将人VEGF、碱性成纤维细胞生长因子与组织工程材料相结合，或在植入材料中结合血管生成基因、血管肽或转染血管内皮细胞表达的多肽[13]，取得了较理想的效果，但均需要加入其他物质对移植物进行物理性和化学性修饰，修饰的方法较为复杂，因而在临床中的应用受到一定限制。

血管生成过程受到多种旁分泌细胞因子调节，VEGF为重要的促血管生成因子，同时也构成了细胞外信号分子中的VEGF／血小板生长因子[14]。正常的生理状态下和病理状态下，VEGF均对机体的血管形成与发展有重要的促进作用，其作用机制在于促进血管内皮细胞的有丝分裂，有利于血管内皮细胞的渗透作用，从而延长其生存周期。本研究结果表明，和聚磷酸钙相比，以掺锶聚磷酸钙支架材料培养的成骨细胞的VEGF分泌量更大，且8%含锶量掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞VEGF分泌量最高，说明锶对成骨细胞VEGF的蛋白表达量具有明显的促进作用。

同时，掺锶聚磷酸钙又能促进成骨细胞的增殖过程，加速在骨修复过程中骨组织再生。这是由于在聚磷酸钙材料中加入锶能促进成骨细胞增殖，这就有更多的细胞处于生长活跃期，能分泌出更多量的VEGF，继而表现出VEGF蛋白表达量提高。此外，锶可改变聚磷酸钙骨修复材料的三维微观结构，更接近于骨组织的正常结构，可为成骨细胞提供了更好的生长环境，从而使VEGF分泌量明显增加[15]。

综上所述，8%含锶量的掺锶聚磷酸钙作为一种新型骨修复材料，能促进成骨细胞分泌VEGF，促进骨修复过程中周围血管生成，具有良好的临床应用前景。

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Effect of Strontium Doped Calcium Phosphate Bone Repair Material on VEGF Protein Secretion in Osteoblasts

Yu Leijun

(Department of Orthopaedics and Traumatology,Zhejiang Tongde Hospital,Hangzhou,Zhejiang,China310012)

Objective To learn the effect of strontium doped calcium phosphate bone repair material on VEGF protein secretion in osteoblasts and to provide a new bone repair material for orthopedics clinic.MethodsThe strontium doped calcium phosphate bone repair materials with different strontium content were prepared.The VEGF protein secretion was measured by ELISA method,and the effect of MTT on the proliferation of osteoblasts was investigated.ResultsThe results of ELISA method after 7 d showed that the secretion of VEGF in osteoblasts of 1%,3%,5%,8%,10%strontium doped calcium phosphate were higher than calcium phosphate,and the differences were statistically significant(t＝6.561,11.454,11.256,15.149,9.778,P＜0.05).Among them,the content of VEGF was the highest in the 8%calcium containing calcium strontium calcium phosphate.The results of MTT method showed that the A values of 3,5,7,9 d was higher than that of the negative control,and the value of the osteoblasts was higher than that of the negative control, and the differences were statistically significant(t＝3.960,5.029,5.229,4.808,2.584,2.954,2.657,2.798,P＜0.05).After culture 5,7,9 d,the A value of the osteoblast of the 8%calcium doped calcium phosphate solution were higher than that of calcium phosphate,and the differences were statistically significant(t＝2.583,2.930,1.934,P＜0.05).ConclusionAs a new bone repair material,strontium doped calcium phosphate can promote the secretion of VEGF,which has a good clinical application prospects.

strontium doped calcium phosphate;bone repair material;osteoblast;vascular endothelial growth factor

R965；R687.3

A

1006－4931(2017)01－0010－04

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.01.003

2016－10－07)

浙江省科学技术厅2014年合作研发和成果转化项目[2014F50005]。

俞雷钧，男，大学本科，副主任医师，主要从事临床脊柱外科工作，（电话）0571－89972350。