不同类型子痫前期患者胎盘组织内NFAT5、MCP-1的表达*

崔世红，高亚南，张琳琳，刘 灵，吴 娟，陈 娟，申琳娜，职云晓

1)郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052 2)河南省产前基因检测工程研究中心 郑州 450052 3)郑州大学第三附属医院B超室 郑州 450052

不同类型子痫前期患者胎盘组织内NFAT5、MCP-1的表达*

崔世红1)△，高亚南1)，张琳琳2)，刘 灵1)，吴 娟3)，陈 娟1)，申琳娜1)，职云晓1)

1)郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052 2)河南省产前基因检测工程研究中心 郑州 450052 3)郑州大学第三附属医院B超室 郑州 450052

△女，1961 年6月生，硕士，教授，研究方向：围产医学，E-mail：1304519087@qq.com

子痫前期；NFAT5；MCP-1；妊娠结局

目的：检测重度子痫前期患者胎盘组织中NFAT5、MCP-1的表达并探讨二者与新生儿结局的关系。方法：采用免疫组化法检测30例早发型重度子痫前期(早发型组)、30例晚发型重度子痫前期(晚发型组)及30例足月妊娠(对照组)孕妇胎盘组织中NFAT5、MCP-1蛋白的表达情况，采用RT-PCR法检测胎盘组织中NFAT5、MCP-1 mRNA的表达情况，分析早发型组2种蛋白的相关性及与新生儿结局的关系。结果：3组胎盘组织中均有NFAT5和MCP-1蛋白的表达；早发型组2种因子的蛋白及mRNA表达水平均高于晚发型组(P<0.05)；晚发型组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0．05)。早发型组胎盘组织中NFAT5与MCP-1蛋白的表达呈正相关(r=0.779，P<0.001)；而NFAT5和MCP-1蛋白分别与新生儿体重(r=-0.760、-0.560，P<0.05)、胎盘质量(r=-0.583、-0.464，P<0.05)呈负相关。 结论：早发型子痫前期胎盘组织中NFAT5、MCP-1的表达均高于晚发型子痫前期，说明两者可能有不同的发病机制。

子痫前期是妊娠期特有的一种复杂的多系统紊乱性疾病，以妊娠期高血压为主要特征[1]。目前多以34周为界，将重度子痫前期分为早发型与晚发型子痫前期，并认为早发型与晚发型子痫前期可能存在不同的发病机制。早发型子痫前期发病早，病情进展快，低出生体重儿、早产和新生儿窒息的发生率高，多数有胎盘发育不良和子宫-胎盘灌注不足；而晚发型子痫前期患者胎盘发育相对正常，但母体可能存在新陈代谢或心血管系统异常[2]。近年来炎性反应、血管内皮损伤成为子痫前期研究的热点。核转录因子5(NFAT5)是核转录因子Rel/NF-κB蛋白家族的一员，是惟一已知的与渗透压转录相关的因子。最近研究[3]表明，NFAT5在子痫前期患者胎盘组织中表达升高。单核细胞趋化因子1(MCP-1)由巨噬细胞、滋养细胞、蜕膜细胞分泌，能够趋化单核巨噬细胞聚集到损伤的血管内皮周围，促进炎性反应[4]。研究[5]发现，MCP-1启动子部位存在NFAT5结合位点，NFAT5可与MCP-1启动子部位DNA识别点结合，二者相互作用，激活下游信号通路，诱导大量炎性因子及TNF-α产生。该研究通过检测NFAT5、MCP-1蛋白及mRNA在早发型及晚发型子痫前期患者胎盘组织中的表达，探讨两者在子痫前期发病中的作用，并分析两者与新生儿结局的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2015年1月至2016年1月在郑州大学第三附属医院住院行剖宫产的60例重度子痫前期患者为研究对象，均符合文献[6]诊断标准，且均未采取辅助生殖技术、自然受孕、单胎妊娠，既往均无高血压、糖尿病、心脏病以及肾脏疾病史；该研究方案经郑州大学第三附属医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书；将其分为早发型组30例，晚发型组30例。另选同期正常孕妇30例作为对照组。

1.2 各组孕妇一般情况的搜集与整理 统计3组研究对象的年龄、分娩孕周、孕时BMI；待新生儿经剖宫产娩出及胎盘娩出后，立即测量新生儿体重及胎盘质量。

1.3 标本采集及处理 行剖宫产术时，在胎盘娩出15 min内立即取母体面中央区域的胎盘组织约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm 2块，避开出血、梗死及钙化区，4 ℃生理盐水漂洗后置于无菌、无酶的1.5 mL EP管中，其中一块立即投入液氮冷却，后转-80 ℃冰箱保存备用。另一块固定于体积分数10%甲醛溶液，常规石蜡包埋切片。

1.4 免疫组化法检测胎盘组织中MCP-1、NFAT5蛋白的表达水平 石蜡标本连续切片，实验步骤严格按照说明书进行。MCP-1、NFAT5单克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司(均按1150稀释)，二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，以PBS代替一抗作为阴性对照。最后以DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，显微镜下观察染色情况。在400倍镜下选取5个视野，每个视野计数100个细胞，采用综合计分法进行半定量分析[7]：以胞膜或胞质出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，无着色或与背景颜色一致为阴性细胞；计算阳性细胞百分率，阳性细胞百分率<5%为0分，5%～为1分，25%～为2分，50%～为3分，75%～为4分；根据细胞染色情况进行评分，无着色为0分，浅棕褐色为1分，棕褐色为2分，深褐色为3分；结果取两者之和。

1.5 RT-PCR法检测胎盘组织中MCP-1、NFAT5 mRNA的表达水平 提取总RNA(试剂购自北京康为试剂公司)，反转录为cDNA后进行RT-PCR。MCP-1、NFAT5引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，NFAT5上游引物5’-GGGTCAAAC GACGAGATT-3’，下游引物5’-CAGAGTCGTTGCCCA CA-3’，片段大小375 bp；MCP-1上游引物5’-CCCCAGTCACCTGCTGTTAT-3’,下游引物 5’-TG GAATCCTGAACCCACTTC-3’，片段大小171 bp；以β-actin为内参，上游引物5’-CAGGAAGGAAG GCTCGAAGAGTG-3’，下游引物5’-GGGAAATCGT GCGTGACATTAAGG-3’，片段大小185 bp。反应条件为95 ℃ 5 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s，共 40 个循环，重复3次。PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，分别以NFAT5、MCP-1与β-actin条带灰度值的比值作为NFAT5和MCP-1 mRNA的相对表达量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 21.0进行统计学分析。3组孕妇的年龄、分娩孕周、孕时BMI、胎盘质量、新生儿体重、胎盘组织中NFAT5及MCP-1蛋白和mRNA相对表达量的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；采用直线相关分析早发型组NFAT5与MCP-1蛋白表达的相关性以及两者分别与胎盘质量和新生儿体重的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组孕妇的一般资料 结果见表1。

表1 3组孕妇一般资料比较

*:与其他2组比较，P<0.05。

2.2 各组胎盘组织中NFAT5与MCP-1蛋白的表达情况 NFAT5蛋白表达于各组胎盘滋养细胞中，大多位于胎盘滋养层与绒毛血管内皮细胞的胞核与胞质中，见图1。MCP-1蛋白表达于绒毛血管内皮细胞与胎盘滋养细胞中，主要位于细胞质内，见图2。 早发型组、晚发型组和对照组胎盘组织中NFAT5和MCP-1蛋白表达的比较，见表2。

A：早发型组胎盘组织；B：晚发型组胎盘组织；C：对照组胎盘组织。图1 NFAT5蛋白在胎盘组织中的表达情况(SP，×400)

A：早发型组胎盘组织；B：晚发型组胎盘组织；C：对照组胎盘组织。图2 MCP-1蛋白在胎盘组织中的表达情况(SP，×400)

表2 各组孕妇胎盘组织中NFAT5与MCP-1蛋白相对表达量的比较

*:与其他2组比较，P<0.05。

2.3 各组胎盘组织中NFAT5与MCP-1 mRNA的表达情况 结果见图3、4和表3。

1：Marker；2～4：分别为对照组、晚发型组、早发型组；5～7：β-actin。图3 各组孕妇胎盘组织中NFAT5 mRNA的表达情况

1：Marker；2～4：β-actin;5～7:分别为对照组、晚发型组、早发型组。图4 各组孕妇胎盘组织中MCP-1 mRNA的表达情况

表3 各组孕妇胎盘组织中NFAT5及MCP-1 mRNA相对表达量的比较

*:与其他2组比较，P<0.05。

2.4 早发型子痫前期患者胎盘组织中NFAT5和MCP-1蛋白表达的相关性分析 结果显示，早发型子痫前期胎盘组织中NFAT5与MCP-1蛋白表达呈正相关(r=0.779,P=0.001)。

2.5 早发型子痫前期患者胎盘组织中NFAT5和MCP-1蛋白表达与新生儿结局的关系 各组孕妇的胎盘质量及新生儿体重见表4。相关分析结果显示，早发型组胎盘组织中NFAT5蛋白表达与新生儿体重、胎盘质量呈负相关(r=-0.760、-0.583，P均<0.05)； MCP-1蛋白表达与新生儿体重、胎盘质量呈负相关(r=-0.560、-0.464，P均<0.05)。

表4 各组孕妇的胎盘质量及新生儿体重比较 g

*:与其他2组比较，P<0.05；#：两两比较，P<0.05。

3 讨论

子痫前期可导致母婴患病率与死亡率升高。胎盘作为联系孕妇与胎儿惟一的纽带，具有物质运输、激素合成、防御病原体的功能。妊娠期间，早期胎盘发育处于低氧环境中，胎儿与母体已适应了这种低氧状态，然而持续缺氧会导致子痫前期和胎儿生长受限等妊娠并发症。有学者[2，8-9]认为，早发型与晚发型子痫前期的发病机制不同，早发型重度子痫前期起源于胎盘，母胎界面的病理生理改变导致子宫螺旋小动脉生理重铸障碍，胎盘浅着床，胎盘灌注减少，缺血缺氧，产生更多的毒性因子损害血管内皮功能，最终导致恶性循环；而晚发型子痫前期患者胎盘发育相对正常，但母体本身可能存在新陈代谢或心血管系统异常。

NFAT5是Rel/NF-κB蛋白家族的一个成员[3]。最新研究[10]发现，子痫前期患者胎盘组织内NFAT5蛋白的表达与对照组相比明显升高，而且在JAR细胞内低氧可诱导NFAT5 mRNA的表达。Park等[3]通过双重免疫荧光染色证实，NFAT5定位于胎盘组织的滋养细胞与绒毛血管内皮细胞，其在子痫前期患者胎盘组织的表达水平高于对照组。Villanueva等[11]发现低氧可诱导NFAT5的核转录与激活，然而在缺氧8 h后NFAT5表达降低导致细胞的凋亡与坏死增加。该研究中，作者采用免疫组化方法和RT-PCR法，分别检测3组孕妇的胎盘组织中NFAT5蛋白和mRNA的表达情况，结果显示，NFAT5在早发型组、晚发型组以及对照组胎盘组织滋养细胞及绒毛血管内皮细胞中均有表达，但在早发型组胎盘组织中表达水平较高，提示早发型组胎盘病变严重，胎盘缺血缺氧，胎盘滋养细胞表达较多的NFAT5，而NFAT5可以改善滋养细胞在低氧环境中过高的张力，对于滋养细胞在缺血缺氧的环境中起到一种代偿作用；然而晚发型组与对照组比较差异无统计学意义，进一步说明早发型子痫前期与晚发型子痫前期的发病机制不同，与既往研究[12]一致。

MCP-1作为趋化因子CC家族成员，与妊娠关系最为密切，可与其配体结合，促进滋养细胞迁移[13]。该研究结果显示，MCP-1主要位于绒毛血管内皮细胞与滋养细胞内，提示MCP-1能趋化炎性因子聚集到血管内皮细胞周围，引起血管内皮功能损伤。研究[14]发现，妊娠中晚期子痫前期患者血浆MCP-1水平显著高于正常孕妇，且随着病情加重而呈增加趋势。该研究中作者发现，胎盘组织中MCP-1蛋白表达在早发型组高于晚发型组，提示MCP-1水平与子痫前期发病程度密切相关。作者进一步分析发现，晚发型组与对照组相比，MCP-1蛋白表达水平并无明显差异，因此推测，晚发型子痫前期发病可能与胎盘关系不大。

最近Kojima等[15]研究发现，在MCP-1的调节区域存在NFAT5的结合位点，NFAT5结合在其转录起始位点的上游186～199 bp的位置，从而促进MCP-1的表达。该研究结果显示，胎盘组织中均有NFAT5与MCP-1的表达，且在早发型子痫前期患者胎盘组织中NFAT5与MCP-1的表达呈正相关；推测NFAT5可通过调节MCP-1的表达参与早发型子痫前期的发病过程，同时也提示MCP-1可能是NFAT5启动活化的炎性因子之一。

研究[16]认为，早发型子痫前期孕妇的新生儿结局较差，主要因为早发型子痫前期与胎盘发育不良密切相关，在妊娠12～13周时，滋养细胞异常侵入子宫螺旋动脉，导致胎盘浅着床，最终造成高血压、蛋白尿等症状，导致新生儿结局不良。该研究中作者发现，早发型重度子痫前期孕妇胎盘组织中NFAT5和MCP-1的表达均与新生儿体重及胎盘质量呈负相关，可能原因是两者共同作用引起滋养细胞凋亡，释放的多种细胞因子透过胎盘屏障进入胎儿脐血内，影响胎儿宫内生长发育，具体机制还有待进一步研究。

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(2016-07-04收稿 责任编辑姜春霞)

Expressions of NFAT5 and MCP-1 in patients with different types of preeclampsia placenta tissue

CUIShihong1),GAOYanan1),ZHANGLinlin2),LIULing1),WUJuan3),CHENJuan1),SHENLinna1),ZHIYunxiao1)

1)DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)PrenatalGeneEngineeringResearchCenterofHenanProvince,Zhengzhou450052 3)DepartmentofB-ultrasoundRoom,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

preeclampsia;NFAT5;MCP-1;perinatal outcome

Aim: To investigate the expressions of NFAT5 and MCP-1 and their relationship with the perinatal outcome in patients with severe preeclampsia. Methods: The expressions of NFAT5 and MCP-1 in 30 case of early-onset preeclampsia(EOPE group), 30 cases of late-onset preeclampsia(LOPE group) and 30 normal control (control group) tissue were detected by immunohistochemistry. RT-PCR was conducted to analyze the expressions of NFAT5 and MCP-1 mRNA in placental tissue. The relationship among the expressions of NFAT5 and MCP-1 protein and the perinatal outcome in EOPE group was analyzed.Results: NFAT5 and MCP-1 protein and mRNA expressions in the EOPE group were both higher than those in the LOPE group(P<0.05). However, there was no difference between the LOPE group and the control group(P>0.05).The expression of NFAT5 was positively correlated with the expression of MCP-1 in the EOPE group(r=0.779,P<0.001). NFAT5 and MCP-1 expressions in the EOPE group was negatively correlated with neonatal weight (r=-0.760，-0.560，P<0.05) and the placental weight(r=-0.583，-0.464，P<0.05).Conclusion: The expressions of NFAT5 and MCP-1 in the EOPE group are both higher than those in the LOPE group, which suggests that they may have different pathogenesis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.019

*河南省医学科技攻关项目 201503109

R714.7