新布尼亚病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的建立*

杜燕华，李 懿，程宁宁，许汴利，黄学勇#

1)河南省疾病预防控制中心河南省医学病原生物学重点实验室 郑州 450016 2)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001

新布尼亚病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的建立*

杜燕华1)，李 懿1)，程宁宁2)，许汴利1)，黄学勇1)#

1)河南省疾病预防控制中心河南省医学病原生物学重点实验室 郑州 450016 2)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001

#通信作者，男，1969年10月生，博士，主任医师，研究方向：分子流行病学，E-mail:huangxy@hncdc.com.cn

新布尼亚病毒；发热伴血小板减少综合征；间接ELISA法

目的：建立基于间接ELISA法检测新布尼亚病毒IgG抗体的血清学检测方法。方法：应用基因工程原核表达的新布尼亚病毒核蛋白，初步建立用于新布尼亚病毒IgG抗体检测的间接ELISA法，用该方法对267例发热伴血小板减少综合征患者急性期和恢复期双份血清和198份标本进行检测，并与间接免疫荧光法的结果进行对比。结果：所建立的新布尼亚病毒IgG抗体间接ELISA检测方法重复性好，与其他病毒无交叉反应。与间接免疫法对267例发热伴血小板减少综合征病例的实验室诊断结果有较好的一致性(Kappa=0.69),健康人血清检测阳性率为5.56%。结论：建立的间接ELISA方法适用于新布尼亚病毒感染的实验室诊断及流行病学调查。

新布尼亚病毒是新发传染病——发热伴血小板减少综合征的主要病原体，2010年在我国首次发现[1-2]。2011至2014年全国23个省份共报告发热伴血小板减少综合征5 352例，河南省报告2 143例，是目前发病最多的省份，也是最早监测该疾病的省份[3]。随着病例发现能力的增加，病例报告人数和检测人数也逐年增加，2015年河南本地报告发热伴血小板减少综合征1 053例，创历年新高。目前实验室诊断主要用新布尼亚病毒的荧光定量PCR方法检测，该方法对仪器设备、实验条件和人员操作的要求都比较高，检测试剂成本也比较高。作者建立了一种基于间接ELISA法检测新布尼亚病毒IgG抗体的血清学检测方法，可用于监测病例的实验室诊断和健康人的血清流行病学调查，报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集267份2012至2015年信阳市发热伴血小板减少综合征实验室确诊病例的血清标本，确诊方法为新布尼亚病毒急性期血清荧光定量PCR检测或IgM检测阳性。每例病例均采集急性期(发病2周内)和恢复期(发病4周以上)非抗凝血各5 mL，共534份血清标本，保存于河南省疾病预防控制中心实验室-70 ℃冰箱。收集同期信阳市平桥区健康体检者血清198份。出血热病毒、乙脑病毒、登革热病毒IgG抗体阳性的血清各10份，由河南省疾病预防控制中心实验室进行实验室确诊并保存。

1.2 间接ELISA检测方法的建立与评价

1.2.1 方法的建立 PCR扩增新布尼亚病毒核蛋白(NP)基因，连接至原核表达载体pMALc2x中，转化大肠杆菌 JM109，IPTG诱导表达、纯化，获得MAB-NP融合蛋白，经纯化和鉴定后的NP抗原由本实验室制备和保存[4]。用NP抗原包被微孔板4 ℃过夜，洗板，加入稀释的血清标本，37 ℃温箱孵育1 h，洗板，加入HRP标记的羊抗人IgG(美国 Qualex公司) 37 ℃温箱孵育1 h，洗板，加入ABTS (美国KPL公司) 37 ℃显色30 min，用酶标仪测定波长405 nm处的OD值。结果判定：临界值=阴性对照平均OD值×2.1，≥临界值的样品判为阳性，反之为阴性。

1.2.2 工作条件的优化 按正交表L16(43)设计安排进行正交实验，确定最佳反应条件，考察的因素有NP抗原包被稀释度(A)、HRP标记的抗人IgG抗体稀释度(B)、样品血清稀释度(C)，每个因素分别有4个水平，详见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.2.3 特异性 将出血热病毒、乙脑病毒、登革热病毒IgG抗体阳性血清各10份，用所建立的间接ELISA检测方法进行交叉实验，确定该方法的特异性。

1.2.4 可重复性 选择2012年信阳市发热伴血小板减少综合征确诊病例血清标本30份，经二次检测，每次同一样本设3个复孔，确定检测符合率并计算变异系数。

1.3 应用效果 将267例病例的急性期和恢复期双份血清标本分别用间接ELISA法与间接免疫荧光(IFA)法检测，新布尼亚病毒IgG抗体阳转或恢复期滴度较急性期4倍以上增高为阳性。IFA操作方法详见参考文献[5]。用所建立的间接ELISA法检测健康体检者血清标本198份，计算阳性率。

1.4 统计学处理 采用SAS 9.1进行数据分析，对间接ELISA法与IFA检测结果进行Kappa一致性检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 间接ELISA法工作条件的确定 正交实验结果(表2)显示，最佳条件是A2B3C3，即新布尼亚病毒NP抗原包被稀释度为12 000(浓度50 μg/孔)，HRP标记的抗人IgG抗体稀释度为130 000，样品血清稀释度1400。通过方差分析(表3)可知，B因素对该方法的影响较大。

表2 正交实验结果(n=4)

表3 正交实验方差分析

2.2 方法学考察结果

2.2.1 特异性 用所建立的间接ELISA检测方法检测出血热病毒、乙脑病毒、登革热病毒IgG抗体阳性血清，结果均为阴性，无交叉反应。

2.2.2 可重复性 30份确诊病例血清标本经重复检测，诊断符合率为100%，变异系数约为6%。

2.3 间接ELISA法临床应用效果 用两种检测法检测267份血样的结果(表4)一致性较好(Kappa=0.69，95%CI=0.58～0.79)。健康体检者血清标本198份经间接ELISA法检测，新布尼亚病毒IgG抗体阳性11份，阳性率5.56%。

表4 间接ELISA法与IFA检测结果的比较

3 讨论

新布尼亚病毒NP蛋白在病毒颗粒内通过与病毒基因组RNA和RNA聚合酶结合形成核蛋白体，在病毒颗粒内丰度很高[6]。SARS、Nipah等很多病毒的血清学诊断方法都选择NP蛋白作为诊断分子，且NP蛋白在整个布尼亚病毒科内具有较强的序列保守性和稳定性，同时又具有种的序列特异性[7]。对流行于非洲、与新布尼亚病毒同属于白蛉病毒属的裂谷热病毒(rift valley fever virus,RVFV)的研究[8]表明，RVFV的NP蛋白分子比构成病毒颗粒的其他分子(如Gn、Gc和病毒基因组RNA)能更早地被宿主细胞释放，因此也就更容易被检测出来。基于上述考虑，作者选取新布尼亚病毒NP蛋白作为诊断分子，建立了一种间接ELISA方法，通过与已知出血热病毒、乙脑病毒、登革热病毒的特异性实验检验，该方法无交叉反应且重复性好，适用于病例标本的实验室检测。

2010年9月原卫生部印发《发热伴血小板减少综合征防治指南(2010版)》，初步认定一种新型布尼亚病毒，暂以发热伴血小板减少综合征命名此病毒感染所致疾病，要求各地参照乙类传染病的要求报告病例，并明确了确诊病例的诊断标准：病例标本新型布尼亚病毒核酸检测阳性，病例标本新型布尼亚病毒IgG抗体阳转或恢复期滴度较急性期4倍以上增高者，病例标本分离到新型布尼亚病毒。疑似病例具备以上三项之一者即为确诊病例。3种实验室确诊方法中，病毒分离虽然是一种最可靠的诊断方法，但耗时长，操作复杂，生物安全要求高，不能满足临床诊断的需要。核酸检测方法虽然适合于病例的快速诊断，但对病例标本采集时限有要求，只有在病毒血症期采集的标本才能保证诊断的准确性。而病毒抗体存在的时间较长，虽然抗体检测方法对于发病早期的病例敏感性不如核酸检测方法，但对于采样距发病时间较长的病例或是隐性感染病例，血清学诊断方法有重要意义。IFA和ELISA法均可用于新布尼亚病毒IgG抗体的检测。该研究将发热伴血小板减少综合征确诊病例血清用两种方法同时检测，结果差异无统计学意义，有较好的一致性。在实际工作中，IFA需要培养病毒，生物安全要求高，操作相对复杂，荧光值判别有一定的主观因素，而该研究所建立的间接ELISA法容易商品化和标准化，操作简便，对实验仪器要求不高，因而特别适合基层大批标本的实验室诊断和人群血清流行病学调查。

[1]许汴利.新布尼亚病毒感染致发热伴血小板减少综合征的发现、认识与启示[J].中华预防医学杂志,2012,46(2):99

[2]XU B,LIU L,HUANG X,et al.Metagenomic analysis of fever, thrombocytopenia and leukopenia syndrome (FTLS) in Henan Province, China: discovery of a new bunyavirus[J].PLoS Pathog,2011,7(11):e1002369

[3]李昱,周航,牟笛,等.中国2011-2014年发热伴血小板减少综合征流行特征分析[J].中华流行病学杂志,2015,36(6):598

[4]胡小宁,黄学勇,杜燕华,等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核蛋白的原核表达与鉴定[J].郑州大学学报(医学版),2014,49(5):636

[5]黄学勇,杜燕华,李幸乐,等.新布尼亚病毒IgG间接免疫荧光检测方法的建立[J].中华预防医学杂志,2012,46(2):165

[6]LE MAY N,GAULIARD N,BILLECOCQ A,et al.The N terminus of Rift Valley fever virus nucleoprotein is essential for dimerization[J].J Virol,2005,79(18):11974

[7]SWANEPOEL R,STRUTHERS K,ERASMUS J,et al.Comparison of techniques for demonstrating antibodies to Rift Valley fever virus[J].J Hyg(Lond),1986,97(2):317

[8]LIU L,CELMA CC,ROY P.Rift Valley fever virus structural proteins: expression, characterization and assembly of recombinant proteins[J].Virol J,2008,5(1):1

(2016-07-15收稿 责任编辑王 曼)

Establishment and application of indirect ELISA of IgG antibody against new bunyavirus

DUYanhua1),LIYi1)，CHENGNingning2)，XUBianli1)，HUANGXueyong1)

1)HenanKeyLaboratoryofPathogenicMicroorganisms,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016 2)DepartmentofEpidemiology，CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

new bunyavirus;fever thrombocytopenia and leukopenia syndrome;indirect ELISA

Aim: To establish an indirect ELISA method for detecting IgG antibody against new bunyavirus. Methods: Based on nucleoprotein gene of new bunyavirus obtained by prokaryotic expression, a qualitative indirect ELISA method for detecting IgG antibody was set up. Using the established method，serum samples from both acute and recovery phases of 267 patients with fever thrombocytopenia and leukopenia syndrome and 198 healthy persons were tested．The results were compared with IFA．Results: The established indirect ELISA method had better repeatability, no cross reaction with other virus. There was no significant difference in results between IFA and indirect ELISA in 267 patients with fever thrombocytopenia and leukopenia syndrome(Kappa=0.69),and the positive rate in the healthy was 5.56%. Conclusion: The indirect ELISA method for detecting IgG antibody against new bunyavirus has been established successfully, which is suitable for laboratory diagnosis and epidemiological investigation for fever thrombocytopenia and leukopenia syndrome.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.005

*国家自然科学基金项目 81573204；河南省医学科技攻关计划项目 201303194

R373.23