口虾蛄总生物碱对人肝癌HepG2细胞抗肿瘤作用实验研究

王槐高，孔霞，郭向华，顾帝水，李彬彬，周艳芳

（广东医科大学病理生理学教研室，广东东莞 523808）

口虾蛄总生物碱对人肝癌HepG2细胞抗肿瘤作用实验研究

王槐高，孔霞，郭向华，顾帝水，李彬彬，周艳芳

（广东医科大学病理生理学教研室，广东东莞 523808）

目的探讨口虾蛄总生物碱对人肝癌HepG2细胞的抗瘤效果。方法口虾蛄酸提碱沉，继以乙酸乙酯萃取；CCK-8法测定不同质量浓度的口虾蛄总生物碱对HepG2细胞增殖的抑制作用；平板克隆实验观察其对HepG2细胞克隆形成能力的影响；流式细胞术检测其刺激HepG2细胞的细胞周期变化。结果口虾蛄总生物碱作用于HepG2细胞24，48，72 h后，CCK－8法检测细胞活性的半抑制浓度（IC50）分别为746.72，47.58，26.32 g／mL；口虾蛄总生物碱（0，10，50，100 g／mL）作用2周后，各组细胞克隆形成率分别为56.1%，35.7%，14.1%，0；口虾蛄总生物碱作用48 h后，HepG2细胞周期的S期比例由26.14%上升为40.80%。结论口虾蛄总生物碱能明显抑制HepG2细胞的生长，这可能通过阻滞细胞周期来实现。

口虾蛄；总生物碱；人肝癌HepG2细胞；细胞；CCX-8法；平板克隆形成试验；细胞周期

肝癌发病率高居全世界第6位，恶性肿瘤死因的第3位[1－2]，为严重危害人类健康的恶性肿瘤。原发性肝癌起病隐袭，症状、体征出现较晚，患者就诊时往往已属中晚期，且多数伴有肝硬化，仅有部分患者能获得手术治疗机会。因肝癌早期无症状，恶性程度高，病情变化快，生存期短，病死率高，故被称为“癌中之王”。近年来，我国肝癌发病率有逐年上升趋势，除了提高肝癌的早期诊断率外，抗肝癌新药的研究开发及应用也显得尤为迫切。近年来的研究发现，口虾蛄提取物对多种肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用[3－5]。本研究中在前期研究的基础上，改进提取分离方法，得到总生物碱，并采用CCK－8法、平板克隆法及流式细胞术法，探讨口虾蛄总生物碱对人肝癌HepG2细胞增殖及细胞周期的影响，为进一步开发研究提供实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物

新鲜口虾蛄（经鉴定属节肢动物门甲壳纲口足目虾蛄科品种）绞碎，以水加浓盐酸浸泡过夜，离心，取上清液，调入浓氨水碱化至pH＞10；上清液及离心后的沉淀分别以乙酸乙酯分次萃取，减压浓缩分别得水提取物（简称L）及沉淀提取物（即总生物碱，简称S）[5]。各提取物分别用二甲基亚砜(DMSO)溶解，分装于4℃冰箱保存。临用时用培养液稀释成所需质量浓度，并使各组分中DMSO的终浓度不超过0.1%。

1.1.2 细胞株

人肝癌HepG2细胞(广东医学院肿瘤研究所)，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

1.1.3 试剂

RPMI 1640培养基（GIBCO公司）；小牛血清（四季青生物材料工程公司）；Cell Counting Kit－8（CCK－8，日本同仁株式会社化学研究所）；DMSO（Sigma公司）；细胞周期检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器

CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司）；Synergy2型多功能酶标仪（美国BioTEK公司）；FACSCantoⅡ型流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 CCK－8法检测L及S对细胞增殖的抑制作用

选用对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，将细胞密度调整为3×104个／mL，96孔培养板每孔100 μL细胞悬液（3×103个／孔），将培养板置37℃、5%CO2、饱和湿度的温箱中培养24 h。再分别加入L和S使终质量浓度分别为0.1，1.0，10.0，100.0，1 000.0 μg／mL，分别培养24 h和48 h后，终止培养前1 h，每孔加入CCK－8溶液，混匀，在细胞培养箱继续孵育2 h后，于酶标仪上450 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值，按试剂盒说明书计算细胞增殖抑制率。抑制率（%）＝（1－实验组OD值／对照组OD值）×100%。采用Bliss法分别计算24，48 h时各提取物的半抑制浓度（IC50）值。

1.2.2 CCK－8法检测S对细胞增殖的抑制作用

根据24 h及48 h的IC50值拟订口虾蛄总生物碱终质量浓度分别为0.8，4，20，100，500 μg／mL，操作方法与1.2.1项下方法相同。

1.2.3 平板克隆实验检测S对细胞克隆形成能力的影响

取对数生长期的HepG2细胞，胰蛋白酶消化，吹打成单个细胞，用细胞计数器计数，用10%胎牛血清的RPMI 1640稀释成1×104个／mL的细胞悬液，6孔板内每孔加入100 μL细胞悬液，再加入1.9 mL 10%胎牛血清的RPMI 1640培养，至细胞贴壁后，吸去孔内培养基，每孔加入2 mL 0.1%胎牛血清的RPMI 1640培养24 h后，加入含不同质量浓度S的10%胎牛血清的RPMI 1640（0，10，50，100 μg／mL）培养，隔3 d换1次含S的溶液，2周后终止培养，弃上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)小心清洗3次，加入甲醇固定30 min，去固定液，加入结晶紫染色30 min，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置，叠加1张带网格的透明胶片，在显微镜（低倍镜）下计数大于10个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率。克隆形成率(%)＝（克隆数／接种细胞数）× 100%。

1.2.4 流式细胞术检测S刺激细胞前后细胞周期变化

调整口虾蛄总生物碱终质量浓度为50 μg／mL，对HepG2细胞作用48 h后，胰酶消化，收集细胞，各待检标本保证细胞总数不少于1×106个，离心，弃上清液，并以70%乙醇固定过夜，第2天离心，弃上清液，用PBS洗2遍后，以含碘化丙啶（PI）100 mg／L和核糖核酸酶(RNase)100 mg／L的染色液0.5 mL，在4℃下避光染色30 min，以流式细胞仪检测细胞周期的变化。

2 结果

2.1 L及S对HepG2细胞增殖的影响

两组分作用24，48 h后，HepG2细胞活性的抑制率见表1。采用Bliss算法得S作用于HepG2细胞24 h和48 h的IC50分别为（211.93±0.54）μg／mL和（23.06±0.72）μg／mL。水提取物（L）组的抑制率过低，未计算IC50。

2.2 S对HepG2细胞生长增殖的影响

S作用24，48，72 h后，HepG2细胞活性的抑制率见表2，显示呈时间依赖性地降低HepG2的存活率。采用Bliss算法得S作用于HepG2细胞24，48，72 h的IC50分别为（746.72±0.68）μg／mL、（47.58±0.35）μg／mL和（26.32±0.56）μg／mL。

表1 L和S在不同时间点对HepG2细胞增殖的影响（±s，%，n＝4）

表1 L和S在不同时间点对HepG2细胞增殖的影响（±s，%，n＝4）

注：不同质量浓度、不同时间点之间相比，P＜0.05。

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表2 S在不同时间点对HepG2细胞生长的影响（±s，%，n＝4）

表2 S在不同时间点对HepG2细胞生长的影响（±s，%，n＝4）

注：不同质量浓度或不同时间点之间比较，P＜0.05。

质量浓度（ g／mL）0.8 4.0 20.0 100.0 500.0 5－Fu（40.0）24 h抑制率2.73±0.38 5.97±0.67 6.01±0.31 18.33±0.45 58.52±0.92 39.45±0.74 48 h抑制率12.44±0.41 22.83±0.78 31.44±0.69 45.95±0.58 85.87±0.55 78.26±0.93 72 h抑制率16.35±0.72 27.91±0.98 35.47±1.11 54.73±0.98 90.32±0.85 84.78±0.37

2.3 S对细胞克隆形成能力的影响

结果见表3。在含0，10，50，100 μg／mL S的培养液孵育2周后，各剂量组细胞克隆形成率依次为56.1%，35.7%，14.1%，0，表明S呈浓度依赖性抑制HepG2细胞的增殖。2.4S对HepG2细胞周期的影响

表3 S对HepG2细胞克隆的影响（±s）

表3 S对HepG2细胞克隆的影响（±s）

注：不同质量浓度组比较，P＜0.05。

样本数质量浓度（ g／mL）0 25 50 100 3333克隆数761±52.3 357±88.5 141±28.8 0

口虾蛄总生物碱作用48 h后，使HepG2细胞周期的S期比例由26.14%上升为40.80%，而G1期比例由64.10%下降为42.40%。详见表4。

表4 S刺激HepG2细胞48 h后细胞周期改变（±s，n＝3）

表4 S刺激HepG2细胞48 h后细胞周期改变（±s，n＝3）

注：与0 g／mL质量浓度组相比， P＜0.05。

S质量浓度( g／mL) 0 50 G1 64.10±0.42 42.40±0.67 26.14±0.37 40.80±0.43 G2／M 9.76±0.85 16.80±0.61

3 讨论

从海洋生物中提取、分离和筛选高效低毒的抗肿瘤活性物质，是目前抗癌药物研究开发的焦点。研究发现，多种海洋生物中含有多肽类、大环内酯类、Pectenotoxin－2[6]及多烯醚类等多种抗癌物质。近年来，海洋微生物代谢产物如生物碱类活性物质的研究备受关注[7]，如中国南海柳珊瑚来源的真菌可产生结构新颖、活性显著、可能具有抗癌活性的新萜类二氢喹啉酮生物碱[8]。海洋生物红树林来源微生物的生物碱类次级代谢产物，在抗菌、抗肿瘤、抗氧化和细胞毒性等方面有着巨大的开发应用潜力[9]。

本课题中采取的系统溶剂提取法[3－5，10]是近年提取分离海洋生物抗癌活性成分的常用方法。其中，口虾蛄乙酸乙酯提取物抑制肿瘤细胞增殖效果较好，正丁醇提取物效果次之，石油醚提取物效果较差。对口虾蛄乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物进行进一步分离和色谱分析鉴定，均可能含有生物碱类物质。在口虾蛄提取物乙酸乙酯及正丁醇提取物的分离、纯化过程中发现，各组分含有的成分较复杂，难以进一步开展研究。总之，近年所采取的口虾蛄系统溶剂提取法，难以进一步分离出较纯的生物碱类物质。本研究中根据口虾蛄的生物碱类物质具有较好的抑制肿瘤细胞增殖的作用，以及乙酸乙酯提取物抑制肿瘤细胞增殖较好的研究基础，采用经典的酸提碱沉法[11]，并用乙酸乙酯直接萃取，实验结果表明，该方法有利于总生物碱类物质的高效提取，又可避免过多杂质的提取。

口虾蛄总生物碱具有的多种生物学活性有待开发。本研究中应用不同质量浓度的口虾蛄总生物碱处理人肝癌HepG2细胞后发现，细胞增殖明显受抑，作用48 h后的IC50为47.58 μg／mL，并呈现剂量－时间－效应关系。此外，口虾蛄总生物碱亦能明显降低人肝癌HepG2细胞的克隆形成能力。流式细胞术检测发现，口虾蛄总生物碱能将人肝癌HepG2细胞周期阻滞在S期，从而抑制细胞的增殖。大量研究表明，一些天然产物可通过细胞周期阻滞以抑制HepG2细胞的增殖。如白藜芦醇可能通过影响CDK2及Cyclin E的活性，使HepG2细胞阻滞在S期，从而抑制肝癌HepG2细胞的增殖[12]；哇巴因（ouabain）和华蟾毒配基（cinobufogenin）可抑制肝癌HepG2细胞的增殖，引起细胞周期S期阻滞，诱导细胞凋亡[13]；蛋白聚糖P1可能通过P27kip1－cyclin A／D1／E－CDK2通路使HepG2细胞阻滞在S期，从而抑制肝癌HepG2细胞的增殖[14]；桑黄多糖P1可能通过提高细胞内Ca2＋浓度及下调多个基因，如CaMKⅡ，EGF，EGFR，K－ras，c－fos的表达，诱导HepG2细胞S期阻滞，从而抑制HepG2细胞增殖[15]。

综上所述，口虾蛄总生物碱可有效抑制人肝癌HepG2细胞的活性，且可将细胞周期阻滞于S期，以诱导细胞凋亡，但具体的凋亡机制、体内动物模型中的抗肿瘤效果和机制有待进一步研究。

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Experimental Studies on the Anti－Tumor Function of the Total Alkaloids of Squilla Oratoria against the Human Hepatoma HepG2 Cell

Wang Huaigao，Kong Xia，Guo Xianghua，Gu Dishui，Li Binbin，Zhou Yanfang

（Department of Pathophysiology，Guangdong Medical University，Dongguan，Guangdong，China523808）

ObjectiveTo extract and analyze the anti－tumor function of the total alkaloids of Squilla oratoria against the human hepatoma HepG2 cell.M ethodsThe total alkaloids of Squilla oratoriawere extracted by acid extraction and alkaline deposition，then isolatedby ethyl acetate；CCK－8 assay，plate clone formation assay，flow cytometry，were performed to measure the effect of the total alkaloids ofSquilla oratoriaon the human hepatoma HepG2 cell.ResultsTheIC50of cell viability on HepG2 cells after treated with S for 24 h，48 h，and 72 h was 746.72 μg／mL，47.58 μg／mL or 26.32 μg／mL，respectively.After treated with S（0 μg／mL，10 μg／mL，50 μg／mL and 100 μg／mL）for two weeks，the cloning efficiency of HepG2 cells was 56.1%，35.7%，14.1%or 0，respectively；AftertreatedwithSfor48h，thehumanhepatomaHepG2cellsinSstagewasincreasedfrom26.14%to 40.80%.ConclusionThe total alkaloids of Squilla oratoria has an inhibitory effect on the cell growth in HepG2 cells through the Pathways of cell cycle arrest.

squilla oratoria；total alkaloids；human hepatoma HepG2 cell；cell counting kit－8 assay；plate clone formation assay；cell cycle

R965；R979.1

A

1006－4931(2017)02－0016－04

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.02.005

2016－08－10；

2016－11－06)

广东建设中医药强省科研项目[20141155]；广东医学院面上基金项目[2xk1310]。

王槐高（1978－），男，硕士研究生，讲师，研究方向为肿瘤防治，（电话）0769－22896324（电子信箱）wanghuaigao＠gdmu.edu.cn。