葛根异黄酮联合维生素D对去势大鼠骨质疏松的防治效果

何正言，梅浩，钟志年

（广东省韶关市第一人民医院，广东韶关 512000）

葛根异黄酮联合维生素D对去势大鼠骨质疏松的防治效果

何正言，梅浩，钟志年

（广东省韶关市第一人民医院，广东韶关 512000）

目的探讨葛根异黄酮联合维生素D对去势大鼠骨质疏松的防治效果及最佳剂量。方法选择3月龄清洁级Wistar雄性大鼠60只，按治疗方法的不同分为对照组、维生素D组、低剂量联合组、中剂量联合组和高剂量联合组，各12只。去势造模成功3个月后开始灌胃给药，其中对照组不用药，维生素D组予维生素D 0.2 mg／kg，低剂量联合组予葛根异黄酮25 mg／kg＋维生素D 0.2 mg／kg，中剂量联合组予葛根异黄酮50 mg／kg＋维生素D 0.2 mg／kg，高剂量联合组予葛根异黄酮100 mg／kg＋维生素D 0.2 mg／kg。各组大鼠均每周二和每周四灌药1次，总给药时间为6个月。实验期末断头处死大鼠，测量股骨长度及质量，并检测骨钙含量和股骨骨密度。结果股骨长度，中、高剂量联合组均显著高于对照组、维生素D组及低剂量联合组（P＜0.05），低剂量联合组与对照组、维生素D组比较均无显著性差异（P＞0.05）；骨质量和骨钙含量，低、中、高剂量联合组均显著高于对照组、维生素D组（P＜0.05），中、高剂量联合组显著高于低剂量联合组（P＜0.05）；中、高剂量联合组股骨长度、骨质量、骨钙含量比较均无显著性差异（P＞0.05）。结论中、低剂量葛根异黄酮联合维生素D对去势大鼠骨质疏松的防治效果较理想。

骨质疏松症；葛根异黄酮；维生素D；去势大鼠；防治效果

骨质疏松症为老年人高发的骨代谢性疾病，以骨量流失和骨组织结构破坏为主要特征，随着骨质病理改变的逐渐加重，患者骨骼脆性增加，极易发生骨折且不易愈合，影响患者生活质量[1]。当前，骨质疏松症治疗以服用钙剂、维生素D及防骨量流失药物为主，但疗效欠佳[2]。中医在补肾健骨方面的研究中，发现了较多健骨壮骨中药材及经典方剂，在骨质疏松症防治方面取得了较好的疗效。葛根是中医治疗项背僵痛的一味良药，现代药理学研究发现其提取物葛根异黄酮具有雌激素样作用，可有效减少骨钙流失[3－4]。为此，本研究中选择60只3月龄清洁级Wistar雄性大鼠作为受试对象，对不同剂量葛根异黄酮联合维生素D灌药后的股骨长度、骨质量、骨钙含量和骨密度进行了对比分析。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物、仪器与试药

1.1.1 动物

选择3月龄清洁级Wistar雄性大鼠60只，体质量180～220 g，广东省实验动物研究中心，合格证号为SCXK（粤）2006－0005。所有动物饲养于实验中心动物室，环境温度为20～25℃，所有大鼠购入后先适应性饲养2周，去势手术前后均自由饮水、摄食。本研究经实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 仪器

MNT－150型游标卡尺（德国美耐特公司）；JJ200型电子分析天平（美国双杰电子有限公司）；原子吸收分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；SD－1000 C型骨矿物仪。

1.1.3 试药

葛根异黄酮（纯度95.0%，杭州东岸医药科技有限公司，批号为20150618）；维生素D滴剂（青岛双鲸药业有限公司，国药准字H20113033，批号为20151012，规格为每粒含维生素D 400 U）。

1.2 处理方法

60只大鼠按治疗方式的不同分为对照组，维生素D组，低、中、高剂量联合组，各12只。常规腹腔麻醉后，无菌条件下完成去势手术，术后5 d内常规抗感染，自由饮水、摄食。待大鼠去势造模成功，恢复饲养3个月后开始灌胃给药。其中，对照组不用药，维生素D组予维生素D 0.2 mg／kg，低剂量联合组予葛根异黄酮25 mg／kg＋维生素D 0.2 mg／kg，中剂量联合组予葛根异黄酮50 mg／kg＋维生素D 0.2 mg／kg，高剂量联合组予葛根异黄酮100 mg／kg＋维生素D 0.2 mg／kg。各组大鼠均于每周二和每周四灌药1次，总给药时间为6个月。除对照组外，维生素D组及低、中、高剂量联合组均将葛根异黄酮＋生理盐水稀释至0.5%的溶液灌胃，维生素D直接灌胃，无需稀释，试验期间各组大鼠均在相同饲养条件下喂养普通饲料。

1.3 观察指标及检测方法

试验期末断头处死大鼠，取左侧股骨，用游标卡尺测量股骨长度，用电子分析天平称定质量；用原子吸收分光光度计测定骨钙含量。股骨骨密度（BMD）用SD－1000C骨矿物仪和Micro－CT测量，分别测定股骨中心和远心骨密度。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 股骨长度

结果见表1。中、高剂量联合组股骨长度均显著高于对照组、维生素D组及低剂量联合组，差异有统计学意义（P＜0.05）；低剂量联合组与对照组、维生素D组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 股骨骨质量和骨钙含量

结果见表1。低、中、高剂量联合组股骨骨质和骨钙含量均显著高于对照组、维生素D组，中、高剂量联合组均显著高于低剂量联合组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。中、高剂量联合组股骨长度、骨质量、骨钙含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠股骨长度、骨质量、骨钙含量比较（±s，n＝12）

表1 各组大鼠股骨长度、骨质量、骨钙含量比较（±s，n＝12）

注：与对照组或维生素D组比较， P＜0.05；与低剂量联合组比较，＃P＜0.05。表2同。

组别对照组维生素D组低剂量联合组中剂量联合组高剂量联合组股骨长度（cm）3.29±0.24 3.33±0.19 3.32±0.21 4.18±0.26 4.20±0.19骨质量（g）0.49±0.06 0.60±0.05 0.71±0.03 0.73±0.03＃0.73±0.04＃骨钙含量（mg／g）140.25±12.14 178.69±10.36 231.04±12.17 250.36±11.26＃252.14±13.14＃

2.3 股骨中心和远心骨密度

结果见表2。低、中、高剂量联合组股骨中心和远心骨密度均显著高于对照组和维生素D组，中、高剂量联合组均显著高于低剂量联合组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中、高剂量联合组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠股骨中心和远心的骨密度比较（±s，g／cm2，n＝12）

表2 各组大鼠股骨中心和远心的骨密度比较（±s，g／cm2，n＝12）

组别对照组维生素D组低剂量联合组中剂量联合组高剂量联合组中心骨密度0.18±0.02 0.21±0.01 0.24±0.03 0.28±0.02＃0.29±0.03＃远心骨密度0.19±0.02 0.21±0.03 0.26±0.02 0.31±0.03＃0.32±0.04＃

3 讨论

葛根异黄酮是用于女性产后、更年期时补充雌激素的一类中药提取物，现代药理学研究发现，其可调节破骨细胞和成骨细胞活性，并促进其增殖，进而维持骨量的稳定[3－4]；还可激活骨细胞骨形态发生蛋白－2 （BMP－2）的活性，维持骨细胞钙质和蛋白质的动态平衡，防治骨质流失效果较好。目前，关于葛根异黄酮联合维生素D治疗骨质疏松疗效的研究相对不足，尤其是其对去势大鼠骨质疏松的防治效果尚有待探讨[5－6]。

本研究结果显示，中、高剂量联合组股骨长度均显著高于对照组、维生素D组及低剂量联合组（P＜0.05），而低剂量联合组与对照组、维生素D组比较均无显著性差异（P＞0.05）；而骨质量和骨钙含量方面，低、中、高剂量联合组均显著高于对照组和维生素D组（P＜0.05），且中、高剂量联合组均显著高于低剂量联合组，但中、高剂量联合组股骨长度、骨质量、骨钙含量比较均无显著性差异（P＞0.05）。可见，中、高剂量葛根异黄酮改善股骨长度、骨质量、骨钙含量的效果均较好，且显著优于低剂量联合组，更有利于改善骨质疏松症。动物试验报道显示，葛根异黄酮中、高剂量（25 mg／kg 或50 mg／kg）联合维生素D 0.2 mg／kg对去势大鼠股骨长度、骨质量、骨钙含量的促增长效果较明显，与本研究中低剂量联合组试验效果较为相似，提示葛根异黄酮中、高剂量（25 mg／kg或50 mg／kg）联合维生素D较合理[7－8]。低、中、高剂量联合组骨中心骨密度和远心骨密度均显著高于对照组及维生素D组（P＜0.05）；且中、高剂量联合组骨中心骨密度和远心骨密度均显著高于低剂量联合组（P＜0.05），但中、高剂量联合组比较均无显著性差异（P＞0.05）。可见，中剂量葛根异黄酮改善骨密度效果更理想。

相关研究显示，葛根异黄酮可介导内分泌、自分泌和旁分泌性的单链多肽等雌激素引起的骨生成反应，同时还可促进大鼠成骨细胞合成和分泌胰岛素样生长因子1（IGF－1），而IGF－1可刺激骨细胞及成软骨细胞的分化和增殖，进而促进骨生成，修复骨质疏松症骨量流失，同时可促进骨生长，纠正骨代谢失衡，对于骨质疏松的发生与发展有良好的抑制作用[9－10]。

目前，骨质疏松症治疗药物中以补充钙质、减少骨质流失、促进钙沉积药物为主，这类药物仅能补充骨质，促进钙沉积，但骨细胞形成的关键因素——Ⅰ型胶原仍然缺乏，骨质较难以形成，骨骼脆性较强，仍易发生骨折，骨代谢平衡与骨量维持仍然较差[11－12]。

近年来，有文献报道显示，葛根异黄酮可促进Ⅰ型胶原的合成，还可促进20余种胶原／非胶原蛋白质、骨代谢局部调节因子等成骨细胞促生物质生成，该作用机制与IGF－1生成、成骨细胞内BMP－2表达增高等密切相关。目前已知葛根异黄酮可促进Ⅰ型胶原的合成，增强碱性磷酸酶的活性，刺激骨细胞产生骨钙素，抑制胶原蛋白酶的活性，从而促进钙沉积，并与Ⅰ型胶原结合，完成了成骨细胞的高效转化，更好地修补破骨细胞骨吸收形成陷窝，损伤修复作用较强，真正实现了骨代谢平衡与骨量维持[13－14]。

本研究中，去势大鼠应用葛根异黄酮联合维生素D治疗后，股骨中心骨密度和远心骨密度大幅提升，与葛根异黄酮可促进Ⅰ型胶原合成、非胶原蛋白质合成、骨代谢局部调节因子激活，增强碱性磷酸酶的活性、抑制胶原蛋白酶的活性等药理作用机制密切相关，且中、低剂量即可较好地改善骨密度，生物利用度良好，临床应用前景可期。但不同剂量葛根异黄酮改善骨密度效果尚存在一定争议，主要集中在中、高剂量方面，较多文献研究认为，高剂量改善骨密度效果较理想，但从本研究来看，中、高剂量葛根异黄酮联合维生素D改善骨密度差异性较小，尚有待进一步深入研究[15－16]。

综上所述，中、低剂量葛根异黄酮联合维生素D对去势大鼠骨质疏松的防治效果较理想，为老年男性骨质疏松症防治带来了新的希望。

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[3]扶晓明，周艳，李梓民，等.葛根异黄酮联合维生素D防治骨质疏松的协同效应（英文）[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（11）：2083－2086.

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Effect of Puerarin Combined with Vitamin D on Osteoporosis in Ovariectomized Rats

He Zhengyan，Mei Hao，Zhong Zhinian

（The First People′s Hospital of Shaoguan，Shaoguan，Guangdong，China512000）

ObjectiveTo investigate the effect of puerarin combined with vitamin D on the prevention and treatment of osteoporosis in ovariectomized rats.M ethods60 male rats of clean grade Wister in March were divided into control group，vitamin D group，low dose group，middle dose group and high dose combination group，12 rats in each group.60 cases of ovariectomized rat model were successfully made.3 months after，the rats in control group were not given any drugs；the vitamin D group was given vitamin D 0.2 mg／kg；the low dose combination group was treated with puerarin isoflavone 25 mg／kg＋vitamin D 0.2 mg／kg；the middle dose combination group was givenpuerariaisoflavone 50mg／kg＋vitaminD 0.2mg／kg；thehigh dosecombinationgroup wasgiven puerariaisoflavone 100 mg／kg＋vitamin D 0.2 mg／kg.The rats in each group were given once every Tuesday and Thursday，the total administration time was 6 months.The rats were sacrificed at the end of the experiment.The femur length and mass were measured.The bone calcium content and bone mineral density were measured.ResultsThe femur length in the middle an high－dose combination group were both obviously longer than the control group and vitamin D group and the low dose group（P＜0.05），but there was no significant difference between the low dose group，the vitamin D group，and the control group（P＞0.05）.The bone mass and bone calcium content in the low，middle and high dose combination groups were obviously higher than the control group and the vitamin D group（P＜0.05）；and the middle and high dose combination group were significantly higher than the low dose group（P＜0.05）.There was no significant differenceinfemurlength，bonemassandbonecalciumcontentbetweenthemiddleandhighdosegroups（P＞0.05）.ConclusionThe effect of middle and low dose of isoflavones combined with vitamin D on osteoporosis in ovariectomized rats is more ideal.

osteoporosis；puerarin；vitamin D；ovariectomized rats；prevention and cure effect

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2017)02－0024－03

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.02.007

2016－10－07；

2016－11－28)

何正言（1977－），男，硕士研究生，主治医师，主要从事骨科疾病的诊疗工作，（电子信箱）69070496＠qq.com。