在线固相萃取-HPLC测定三七消痔栓中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量测定

许辉，刘军，代鹏程，李红兵

（中国人民解放军第291医院，内蒙古 包头 014040）

在线固相萃取-HPLC测定三七消痔栓中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量测定

许辉，刘军，代鹏程，李红兵

（中国人民解放军第291医院，内蒙古 包头 014040）

目的：建立三七消痔栓中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定的方法。方法：运用在线固相萃取-HPLC测定三七消痔栓中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量。结果：含量测定结果准确，方法简便，专属性强；三七皂苷R1（C47H80O18）、人参皂苷Rg1（C42H72O14）和人参皂苷Rb1（C54H92O23）的平均回收率分别为97.21%（RSD＝1.75%，n＝6），99.26%（RSD＝1.80%，n＝6），100.48%（RSD＝1.37%，n＝6）。三七皂苷R1、参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1分别在2.794～27.94 µg/mL，8.125～81.25 µg/mL和8.088～80.88 µg/mL范围内呈良好的线性关系。结论：本方法可有效控制三七消痔栓中三七的质量。

三七消痔栓；在线固相萃取；高效液相色谱法;含量测定

三七消痔栓是我院临床应用40多年的自制剂，由三七、红花、川芎、冰片等药材组成。功能活血化瘀、止血止痛、消炎杀菌、散敛生肌、行气升提、润肠通便。用于肛裂、内痔、外痔、混合痔、肛瘘等肛门疾患和术后出血疼痛。三七是方中主药，因此选定人参皂苷Rg1（C42H72O14）、人参皂苷Rb1（C54H92O23）和三七皂苷R1（C47H80O18）的总量计不得少于5%为该制剂的含量测定项目，以制定该制剂的质量标准。

1 仪器与试药

仪器：UltiMate 3000高效液相色谱仪（Thermo Fisher），包括UltiMate 3000 RS双三元泵，UltiMate 3000 RS二极管阵列检测器，UltiMate 3000 RS自动进样器，UltiMate 3000 RS柱温箱，变色龙7色谱工作站。

分析柱：Thermo ODS HYPERSIL 250mm×4.6mm，5μm。

固相萃取柱：SHIMADZU Shim-pack GVP-ODS 10mm×4.6mm，5μm。

滤膜0.45 μm,Φ13 mm（上海兴亚净化材料厂）三七阴性样品自制。

中药饮片经鉴定均符合《中华人民共和国药典》（2015年版）一部规定[1]。

人参皂苷Rg1对照品（C42H72O14）（批号：110703-200726）、人参皂苷Rb1对照品（C54H92O23）（批号：110704-200318）和三七皂苷R1对照品（C47H80O18）（批号：110745-200516）均由中国药品生物制品检定所提供；三七消痔栓委托加工自制制剂；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 含量测定

2.1 在线固相萃取流程连接色谱条件

流路连接：

进样泵（左泵）→进样器→六通阀接口1；

分析泵（右泵）→六通阀接口3；

六通阀接口2→固相萃取柱→六通阀接口5；;

六通阀接口4→分析柱→紫外检测器；

六通阀接口6→废液。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（250 mm× 4.6 mm，5 μm，10 mm×4.6 mm，5 µm）；以乙腈为流动相A，水为流动相B，按下述方法进行在线固相萃取分析；检测波长203 nm。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于23 000。流速：1 mL/min；柱温：30℃。梯度淋洗条件见表1。

表1 梯度淋洗条件

2.2 对照品溶液的制备

取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，精密称定，加50%乙醇水制成每1 mL含人参皂苷Rg124 μg、人参皂苷Rb124 μg和三七皂苷R16 μg的混合溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取本品两粒，精密称定，置100 mL标准磨口烧瓶中，精密加入50 mL 50%乙醇水，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，用50%乙醇水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定[2]。

2.5 系统适用性

按样品工艺制备缺三七的阴性对照品，按供试品溶液的制备项下操作，结果高效液相色谱（HPLC）图谱在与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1相应的位置上没有吸收峰，表明其他成分对测定无干扰，见图1。

2.6 重现性与稳定性试验

按正文方法平行制备6份供试品溶液，每份进样两次。取平均值计算各被测物相对含量，RSD均小于2%。取其中1份供试品溶液于0，1，2，5，7，44 h测定，结果44 h峰面积基本不变，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的相对标准偏差（RSD）分别为0.96%，1.06%和1.90%。见表2～5。

图1 成分含量测定HPLC色谱图

表2 三七皂苷R1的重现性试验

表3 人参皂苷Rg1的重现性试验

表4 人参皂苷Rb1的重现性试验

表5 稳定性试验

2.7 精密度试验

按“2.3”方法制备供试品溶液，重复进样6次，以各被测物峰面积计算，RSD均小于2%。见表6～7。

2.8 线性关系的考察

配制适当浓度的混合标准品溶液，分别进样2，4，8，12，16，20 μL，以对应浓度及峰面积计算线性回归曲线。以峰面积为纵坐标（Y），被测组分浓度（µg/mL）为横坐标（X），进行线性回归，分别得到三七皂苷R1、参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的回归方程：

Y＝0.0546X－0.0035（r2＝0.9998），

Y＝0.0714X－0.0003（r2＝1），

Y＝0.042X＋0.0048（r2＝0.9998）；

分别在2.794～27.94 µg/mL，8.125～81.25 µg/mL和8.088～80.88 µg/mL范围内呈良好的线性关系。见图2～4。

表6 精密度试验

表7 对照品试验

图2 三七皂苷R1线性回归曲线

图3 人参皂苷Rg1线性回归曲线

图4 人参皂苷Rb1线性回归曲线

2.9 回收率试验

精密称取消痔栓1粒，分别加入对应含量80%，100%，120%的标准品，按“2.3”方法加入100 mL标准磨口烧瓶中制备供试品溶液，测定峰面积，计算回收率。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1平均回收率分别为97.21%，RSD＝1.75%；99.26%，RSD＝1.80%；100.48%，RSD＝1.37%。见表8。

表8 回收率试验

2.10 样品测定

表9 3批产品含量测定

按《中华人民共和国药典》（2015年版）三七含量测定项下规定总皂苷含量不低于5%，折算本制剂每粒含量总皂苷应不低于1.2 mg/粒。3批产品均高于上述值，故采用《中华人民共和国药典》（2015年版）规定折算值1.2 mg/粒。

3 讨论

3.1液相分析中，为消除基质干扰，考察了30%，50%，70%乙醇水作为提取溶剂，50%乙醇水提取效果最好，甘油脂残留较小。

3.2因三七在制剂中含量较低仅为千分之九，参照《中华人民共和国药典》（2015年版）液相色谱方法检测，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1三成分出峰时间长，峰小，信噪比不足，无法满足质量控制分析要求，故采用在线固相萃取富集净化后分析。不但大幅提高了信噪比，还使得分析时间比《中华人民共和国药典》（2015年版）方法缩短一半，不到30分钟。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版）一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:11-12.

[2] 张岩,马晓斐,吕品,等.在线二维柱切换高效液相色谱法同时测定牙膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1[J].分析化学,2014,42(12):1833-1837.

本文编辑：苏日力嘎

Determination of Notoginsenoside R1, Ginsenoside Rg1and Ginsenoside Rb1Contents in Sanqixiaozhishuan by Online Solid Phase Extraction-HPLC

Xu Hui, Liu Jun, Dai Peng-cheng, Li Hong-bing
( The No. 291 Hospital of PLA, Inner Mongolia Baotou 014040, China )

Objective：To establish a method for determination of the contents of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in sanqixiaozhishuan.Methods：The contents of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in sanqixiaozhishuan was determined by online solid phase extraction-HPLC.Results：The developed method was accurate, simple and specif c. The average recovery rates of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in sanqixiaozhishuan were 97.21% (RSD＝1.75%, n＝6), 99.26% (RSD＝1. 80%, n＝6) and 100. 48% (RSD＝1. 37%, n＝6), while the linear ranges were 2.794～27.94, 8.125～81.25 and 8.088～80.88 µg/mL, respectively. Conclusions：The method may be used for effective control of the quality of pseudo-ginseng in sanqixiaozhishuan.

Sanqixiaozhishuan; Online Solid Phase Extraction; High Performance Liquid Chromatography (HPLC);Content Determination

R927.2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.005

2016 - 10 - 09

许辉，男，主管药师。研究方向：药剂学。通讯作者E-mail：18604714500@163.com