111株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLST基因分型研究

2017-04-07刘德华胡大春保静菲古文鹏姚为群

中国合理用药探索 2017年2期

刘德华，胡大春，保静菲，古文鹏，姚为群

（1．昆明医科大学附属甘美医院检验科，云南省昆明市临床疾病分子生物学重点实验室，云南昆明 650011；2．云南省疾病预防控制中心，云南昆明 650211；3．昆明医科大学附属甘美医院感染科，云南昆明 650011）

刘德华1，胡大春1，保静菲1，古文鹏2，姚为群3

目的：回顾性调查昆明医科大学附属甘美医院2010年10月 - 2013年12月分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株的多位点序列分型（MLST）基因分型状况及流行趋势，为防控MRSA暴发提供数据资料。方法：收集昆明医科大学附属甘美医院2010年10月 - 2013年12月连续分离的非重复MRSA 111株，通过MLST分析获得7个管家基因的等位基因谱，提交至MLST网站确定序列型（ST），进一步结合病历资料获取科别及时间段的集中流行趋势。结果：111株MRSA经MLST分析得到11个 ST序列型，发现其中104株细菌集中在ST239、ST5、ST7和ST15型别，尤其是ST239和ST5型。ST239共有43株，且86.05%（37/43）集中于2010年10月 - 2011年2月，主要出现在呼吸科、神经外科、ICU和乳腺科4个科室；ST5共有42株，且80.95%（34/43）集中于2013年7 - 10月，主要出现在呼吸科、神经外科、ICU、干疗科和乳腺科5个科室；ST7为11株；ST15为8株；ST641、ST6、ST9、ST59、ST965、ST88、ST217各1株。结论：昆明医科大学附属甘美医院MRSA的ST型别多样化，但主要流行克隆系为ST239和ST5，ST7、ST15、ST464、ST6、ST9、ST59、ST965、ST88、ST217等克隆系也有分布。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；多位点序列分型；基因分型；流行趋势

MRSA是世界范围内引起医院内感染的重要病原菌[1]，且具有多重耐药性，又易引起感染的暴发和流行。本文兹对昆明医科大学附属甘美医院近年来收集的111株MRSA进行MLST流行病学调查，以了解MRSA的分子特征及医院内感染的暴发，从而为今后控制MRSA的感染以及暴发提供有力依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株收集2010年10月 - 2013年12月昆明医科大学附属甘美医院临床标本中分离的MRSA共111株，所有菌株均为同一时间内连续分离的非重复株，同一患者只取第一次分离株。分离鉴定后的菌株于-40℃冰箱保存。111株MRSA中67株来源于深部痰液及肺泡灌洗液，占60.36%；分泌物（包括创面分泌物、脓液、穿刺液等）28株，占25.23%；导管尖端5株，占4.5%；胸腹水4株，占3.6%；尿液3株，占2.7%；血液3株，占2.7%；脑脊液1株，占0.9%。MRSA主要分离自呼吸内科、ICU、神经外科、乳腺科、干疗科及其他科室。呼吸内科和ICU MRSA共计50株，占总分离株的45.05%。质控菌株：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300，由卫生部临床检验中心赠送。

1.1.2 主要仪器低温超速离心机（Heraeus公司），PCR扩增仪（MyCyclery，Bio-Rad公司），电泳仪（Power PAC 3000，Bio-rad公司），凝胶成像分析系统（Gel Doc 2000 TM，Bio-rad公司）。

1.1.3 试剂Lysostaphin（SD9001）（TaKaRa，日本）；TaqDNA聚合酶、MgCl2及dNTP（Promega，美国，TaKaRa，日本）。PCR引物合成及MLST产物测序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取取血平板上分纯后新鲜过夜6～8个单个菌落，混悬于0.3 mL含有50 U/mL Lysostaphin的TE中（pH＝8.0），35℃水浴30 min，95℃煮沸10 min，15 000 rpm离心20 sec后取上清即为细菌总DNA溶液，测OD值检测DNA含量。

1.2.2 MLST分型反应体系为50 μL。7个管家基因（arcc，aroe，glp，gmk，pta，tpi，yqil）PCR所用的引物参照文献[2]，引物arcc up-5’ TTG ATT CAC CAG CGC GTA TTG TC-3’,arcc dn-5’ AGG TAT CTG CTT CAA TCA GCG-3’; aroe up-5’ ATC GGA AAT CCT ATT TCA CAT TC-3’,aroe dn-5’ GGT GTT GTA TTA ATA ACG ATA TC-3’; glp up-5’ CTA GGA ACT GCA ATC TTA ATC C-3’,glp dn-5’ TGG TAA AAT CGC ATG TCC AAT TC-3’; gmk up-5’ ATC GTT TTA TCG GGA CCA TC-3’,gmk dn-5’ TCA TTA ACT ACA ACG TAA TCG TA-3’; pta up-5’ GTT AAA ATC GTA TTA CCT GAA GG-3’,pta dn-5’ GAC CCT TTT GTT GAA AAG CTT AA-3’; tpi up-5’ TCG TTC ATT CTG AAC GTC GTG AA-3’,tpi dn-5’ TTT GCA CCT TCT AAC AAT TGT AC-3’; yqil up-5’ CAG CAT ACA GGA CAC CTA TTG GC-3’,yqil dn-5’ CGT TGA GGA ATC GAT ACT GGA AC-3’。PCR反应条件：95℃预变性5 min，然后94℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1 min循环35次，后72℃延伸5 min。片段大小从402～516 bp不等。PCR产物纯化后进行双向测序。

1.2.3 MLST数据处理及分析将上述测序产物上传MLST网站（http://www.mlst.net/）的金黄色葡萄球菌数据库（http://saureus.mlst.net/）中的Locus Query下的Single locus进行7个等位基因数据的分析，得出7个等位基因号；通过数据库中Prof le Query下的Allelic对7个等位基因号进行分析，得到每株菌的ST型别。

1.2.4 对相同ST型别结合病历资料获取分布科别及时间段的集中流行趋势。

2 结果

111株MRSA进行MLST检测，其PCR产物电泳结果举例见图1。

111株MRSA进行MLST检测，其测序结果举例见图2。

111株MRSA的MLST共有11种分型，结果见表1。

根据MLST结果及菌株分离的时间和科别进行分析，111株MRSA的流行时间分布情况见图3；科别分布情况见图4。

图1 MRSA的MLST检测PCR扩增产物电泳

图2 MRSA的MLST测序

表1 111株MRSA的MLST结果

图3 111株MRSA各型别的流行时间分布

图4 111株MRSA各型别的科别分布

3 讨论

常用的MRSA菌株分子流行病学分型方法包括脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型、MLST、SCCmec分型和spa分型等。PFGE方法依据脉冲电泳条带的差异进行分型，虽分辨率高被认为是分型的金标准，但其难以将分型结果数字化，不利于不同实验室之间分型结果的比较[3]。本研究采用的MLST方法是目前MRSA分型的主要方法，分型的结果都很容易数字化，方便构建标准的开放数据库网站，有利于不同地区的分子流行病学数据比较。其技术在实验过程的可操作性及实验结果的可靠性之间取得了平衡，同时该方法简便快捷、重复性强、分辨率高[4-5]。

本研究发现，其中104株细菌集中在ST239、ST5、ST7和ST15型别中，尤其是ST239和ST5型。ST239克隆株在巴西首次被发现，此后在世界各地广泛流行[6]，是引起亚洲院内感染的主要克隆株，约90%MRSA的感染是由ST239克隆引起的[7]。从流行病学角度来看主要和近年报道的医院获得性流行菌株（HA-MRSA）分型一致。本研究中ST239共有43株，主要出现在呼吸科、神经外科、ICU和乳腺科4个科室；ST5共有42株，主要出现在呼吸科、神经外科、ICU、干疗科和乳腺科5个科室。而近年来国内报道的MRSA流行也多以HA-MRSA为主，国内多家医院收集菌株的流行病学调查发现以ST239和ST5代表的HA-MRSA在院内广泛流行[8]。王艳海等[9]报道的鄂尔多斯地区蒙古族人群耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLST基因分型结果也一致；据朱佩琼等[10]报道浙江省内流行最广的主要有ST239、ST5和ST59型，同时这些克隆型的耐药性也普遍较高；杨永刚等[11]报道杭州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLST检测共发现9个ST型（以ST5为主，占59.3%；其次为ST239，占16.3%）；熊祝嘉等[12]调查中国7所教学医院MRSA的流行和耐药情况中，ST5型克隆的检出率高达24.6%，仅次于ST239克隆的74.6%，已成为中国大陆以及其他亚洲地区第2位主要的MRSA流行克隆型，需引起高度重视。

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本文编辑：张钰

Multilocus Sequence Typing of 111 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Strains

Liu De-hua1, Hu Da-chun1, Bao Jing-fei1, Gu Wen-peng2, Yao Wei-qun3
(1. Department of Laboratory Medicine, Calmette Hospital Aff liated to Kunming Medical University, Key Laboratory of Clinical molecular Biology of Kunming City, Yunnan Province, Yunnan Kunming 650011, China; 2. Yunnan Centre for Disease Control, Yunnan Kunming 650211, China; 3. Department of Infection, CalmetteHospital Aff liated to Kunming Medical University, Yunnan Kunming 650011,China)

Objective：To investigate the sultilocus sequence typing (MLST) and epidemic trend of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) strains isolated in Calmette Hospital Affiliated to Kunming Medical University from October 2010 to December 2013 retrospectively, and provide a basis for the prevention and control of MRSA outbreak.Methods：A total of 111 non-repetitive methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains were collected from October 2010 to December 2013 in the Calmette Hospital Aff liated to Kunming Medical University, from which seven housekeeping genes alleles were obtained by MLST and submitted to MLST webstite to determine the sequence type (ST), and the result was used for prediction of epidemic trend in combination with clinical data acquisition.Results：A total of 11 ST series were obtained from the 111 strains of MRSA by MLST. A portion of 104 strains belonged to ST239, ST5, ST7 and ST15, especially ST239 and ST5. Forty-three strains belonged to ST239, of which 37 (86. 05%) were found from October 2010 to February 2011, mainly in the department of respiratory diseases, department of neurosurgery, ICU and department of breast diseases. Forty-two strains belonged to ST5, of which 34 (80.95%) were found from July 2013 to October 2013, mainly in the departmentof respiratory diseases, department of neurosurgery, ICU, geriatrics and department of breast diseases. In addition, 11 strains belong to ST7, 8 to ST15 8, and one to each of ST641, ST6, ST9, ST59, ST965, ST88 and ST217.Conclusion：The ST of MRSA strains in Calmette Hospital showed diversity, of which the mainly popular clones were ST239 and ST5, and the distributions of ST7, ST15, ST464, ST6, ST9, ST59, ST965, ST88 and ST217 clones were also found.

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA); Multilocus Sequence Typing (MLST); Genotyping; Epidemic Trends

R446.5

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.002

2016 - 07 - 30

云南省教育厅科学研究基金项目（项目编号：2015Y161）；云南省教育厅科学研究基金项目（项目编号：2010C097）；昆明市卫生科技人才培养项目暨“十百千”工程培养计划[项目编号：SW（带）-09]

刘德华，男，硕士，讲师。研究方向：细菌耐药机制及流行病学。通讯作者E-mail：liudehua12340244@sina.com.cn