傣药望江南中的一个新的降倍半萜类化合物及其活性研究

秦瑞欣+左茜++黄萧涵

[摘要]对傣药望江南Cassia occidentalis的化学成分进行研究，望江南细枝采用乙醇提取，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物用硅胶柱色谱及PRHPLC制备色谱技术进行多次分离，得到1个降倍半萜3异丙基1，6二甲氧基5甲基萘7醇1和一个倍半萜 2，7二羟基4异丙基6甲基萘1甲醛2，其结构通过谱学数据鉴定。化合物1为新化合物，化合物2也首次从望江南中分离得到。并用 MTT 法测定了化合物1对 NB4，A549，SHSY5Y，PC3，MCF7 5 株人癌细胞株的细胞毒活性，其 IC50分别为（18±02）， （12±02）， （09±01）， （22±03）， （26±03） μmol·L-1。

[关键词]望江南； 降倍半萜； 细胞毒活性

A new norsesquiterpene from Cassia occidentalis and its bioactivity

QIN Ruixin1，2， ZUO Qian1*， HUANG Xiaohan1， MA Hangying 2， YANG Yan2， XING Huanhuan2，

ZHOU Ling2， ZHOU Min2， HU Qiufen2

（1The High School Affiliated to Yunnan Normal University， Kunming 650106， China；

2 Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources， State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education， Yunnan Minzu University， Kunming 650106， China）

[Abstract]The phytochemistry investigation on the Cassia occidentalis， a Dai Medicine， was carried out The C occidentalis was extracted with ethanol and then partitioned with EtOAc The EtOAc soluble materials were subjected repeatedly to column chromatography on silica gel and preparative RPHPLC， leading to isolation of a norsesquiterpene， 3isopropyl1，6dimethoxy5methylnaphthalen7ol （1）， and a sesquiterpene， 2，7dihydroxy4isopropyl6methylnaphthalene1carbaldehyde （2） Their structures were determined by means of spectroscopic studies Compound 1 is a new compound Compound 2 is also isolated from C occidentalis for the first time In addition， the cytotoxicity of compound 1 for NB4， A549， SHSY5Y， PC3， and MCF7 cells line was assayed by using the MTT method， and it displayed potential cytotoxicity for the tested cancer cellline with IC50 valves of （18±02）， （12±02）， （09±01）， （22±03）， （26±03） μmol·L-1， respectively

[Key words]Cassia occidentalis； norsesquiterpenes； cytotoxic activity

doi：10.4268/cjcmm20162316

望江南Cassia occidentalis Linn为豆科决明属植物，现广布于全世界热带地区，在我国主要发布在东南部、南部及西南部各省区，是村边荒地习见植物[1]。该植物为我国傣族民间常用的中草药，常用作缓泻剂；种子炒后治疟疾，根有利尿功效，鲜叶捣碎治毒蛇毒虫咬伤；叶、根、种子中所含的挥发油，对多种细菌有抑制作用[2]。

目前国内外学者对望江南进行过一些研究，主要报道的化学成分有蒽醌、甾体、黄酮、萜类等类型的化合物[35]，这些化合物表现出抗菌、抗肿瘤、抗疟疾、抗病毒等多种活性。为充分利用我国丰富的资源，进一步寻找新的活性天然产物，本文对产于西双版纳的望江南细枝化学成分进行了研究，并从中分离到1个降倍半萜类化合物1和1个倍半萜类化合物（2），其中化合物1为新化合物，并且该化合物具有显著的细胞毒活性。化合物（2）也首次从望江南中分离到。

1材料

UV2401A 紫外光谱仪 （日本岛津公司）；BioRad FTS185 傅里叶变换红外光谱仪 （美国伯乐BIORAD 公司）；DRX500 型核磁共振仪 （瑞士布鲁克公司）；半制备 HPLC 分析仪器为安捷伦公司 1200 型高效液相色譜仪，色谱柱为安捷伦公司 Zorbax PrepHT GF （212 mm ×250 mm， 7 μm）。拌样时使用 80～100 目硅胶，柱色谱时使用 200～300 目硅胶，薄层色谱用GF254 （100 mm×100 mm） 硅胶板，均为青岛海洋化工厂生产；薄层色谱显色剂为 5% H2SO4乙醇溶液；工业用氯仿、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇；实验用水为超纯水。

望江南于 2014年8 月购自云南西双版纳傣医院，产地为云南西双版纳洲勐腊县，经西双版纳傣医院林艳芳主任医师和云南民族大学民族药资源化学重点实验室杨青松教授鉴定为豆科决明属植物望江南；植物标本（编号YMU20140822）保存于云南民族大学民族药资源化学重点实验室标本馆。

2提取分离

取望江南的细枝 28 kg晒干，粉碎到 30 目，然后用 95% 的乙醇水超声提取4 次 （每次 30 min，乙醇用量50 L）；提取完后合并提取液并加入500 mL的水，减压蒸去乙醇；残余液用乙酸乙酯萃取3次（每次用乙酸乙酯500 mL），合并乙酸乙酯相减压浓缩得浸膏638 g。浸膏用 60 g （80～100 目） 粗硅胶拌样，然后用 420 g硅胶 （200～300目） 柱色谱分离，以氯仿丙酮（9∶1， 8∶2， 7∶3， 6∶4， 5∶5， 1∶2） 梯度洗脱，分成 6 个部分。选取 8∶2 洗脱部分进行 HPLC进一步分离：用 Zorbax PrepHT GF （212 mm×250 mm） 反相柱，52% 甲醇为流动相，流速为 20 mL·min-1，收集 286 min 的色谱峰可得化合物1（118 mg）。选取 7∶3 洗脱部分用Zorbax PrepHT GF （212 mm × 250 mm） 反相柱，以40% 甲醇为流动相，流速为 20 mL·min-1，收集 224 min 的色谱峰可得化合物2（154 mg），见图1。

3结构鉴定

化合物1为浅黄色胶状物；高分辨质谱 （HRESIMS） 给出准分子离子峰m/z 283130 5 [M+Na]+ （计算值283131 0），结合1H和13 CNMR谱， 推测分子式为C16H20O3，不饱和度为7。红外光谱数据证实化合物中存在羟基（3 428 cm-1）和芳环（1 610，1 548，1 469 cm-1）功能团，紫外光谱在312，256 nm处有强吸收也证实化合物中存在芳环结构。从1H和13CNMR谱（数据归属见表1）信号可以看出化合物中有10个双键碳[C1～10，包括3个次甲基双键碳（C2，C4和C8）]、1个异丙基（C11～13；H11～13）、1个甲基（C14，H14）、2个甲氧基（δC 561 q，614 q；δH 382 s，390 s），以及1个酚羟基（δH 1062）。由于化合物的不饱和度为7（除去10个双键碳的不饱和度5），化合物中还应有2个环；考虑到其他确定的取代基（异丙基、1个甲基、甲氧基和酚羟基）均没有成环的可能，可初步推测10个双键碳形成了1个萘环。根据H8 （δH 705）和C1 （δC 1551）、C6 （δC 1517）、C7 （δC 1482）、C9 （δC 1217）、C10 （δC 1301），H4 （δH 688）和C2 （δC 1063）、C3 （δC 1337）、C5 （δC 1229）、C9 （δC 1217）、C10 （δC 1301），以及H2 （δH 641）和C1 （δC 1551）、C3 （δC 1337）、C4 （δC 1136）、C9 （δC 1217）的HMBC相关见图 2，可进一步确定化合物中存在萘环结构。并且通过上述核磁共振信号和文献[6]对比，可证实化合物1为芳构化桉叶烷类型降倍半萜。化合物的母核得到确认后，剩余的甲基、异丙基、甲氧基和酚羟基为母核上的取代基。根据H11 （δH 331） 和C2 （δC 1063）、C3 （δC 1337）、C4 （δC 1136），H12，13 （δH 139）和C3 （δC 1337），以及H2 （δH 641）、H4 （δH 688）和C11 （δC 335）的HMBC相关可证实异丙基取代在萘环的C3位；根据H314 （δH 240）和C5 （δC 1229）、C6 （δC 1517）、C10 （δC 1301）的HMBC相关，可证实该甲基取代在母核的C5位；根据2个甲氧基氢（δH 382 s，390 s）分别和C1 （δC 1551）和C6 （δC 1517）有HMBC相关，可证实2个甲氧基分别取代在母核的C1和C6位；根据酚羟基氢（δH 1062）和C6 （δC 1517）、C7 （δC 1482）、C8 （δC 1033） 的HMBC相关，可证实酚羟基取代在母核的C7位；而且萘环上典型的氢谱信号[ 705 s，688 （d， J=22 Hz），641 （d， J=22 Hz） ]也支持由HMBC相关证实的取代基位置。至此本化合物的结构得以确定，并命名为3异丙基1，6二甲氧基5甲基萘7醇。化合物（2）为已知化合物，通过其核磁共振数据和文献[6]对比被鉴定为2，7二羟基4异丙基6甲基萘1甲醛。

4波谱数据

化合物1浅黄色胶状物， 分子式为C16H20O3； ESIMS （正离子模式） m/z 283 [M+Na]+； HRESIMS m/z 283130 5 [M+Na]+ （计算值为283131 0），推测分子式为C16H20O3Na。UV （MeOH）λmax （log ε） 312 （362）， 256 （340）， 215 （418） nm； IR （KBr） λmax 3 428， 3 050， 2 942， 1 610， 1 548， 1 469， 1 353， 1 254， 1 207， 1 131，

5化合物的细胞毒活性

对化合物1进行了细胞毒活性筛选。细胞毒活性检测参照文献[9]采用改良的 MTT 测定法，以紫杉醇为阳性对照药，采用了 5 种人源癌细胞株：急性早幼粒细胞白血病细胞（NB4）、人肺腺癌细胞（A549）、人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）、人前列腺癌细胞（PC3）和人乳腺癌细胞（MCF7），所有肿瘤细胞均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。具体实验步骤如下：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100 μL，铺板使待测细胞密度调为 1万/孔。在 5% CO2，37 ℃ 的条件下孵育至细胞贴壁，加入浓度梯度的药物（设0，02，1，25，5，10 μmol·L-1 6个浓度梯度，每孔 100 μL），继续在 5% CO2，37 ℃条件下孵育 24～72 h，倒置显微镜下观察。再往每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 g·L-1，即 05% MTT），继续培养 4 h 后终止培养，小心吸去孔内培养液，接着每孔加入 150 μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测 A490 nm处测量各孔的吸光值。计算药物对细胞生长的抑制率。同时设置空白组（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。通过测定药物在不同浓度下对细胞的抑制率；抑制率=（A空白-A加药孔）/空白对照A×100%；并采用改良寇式法计算IC50。每个化合物平行测定3次，结果取平均值，测定结果为：紫杉醇的 IC50分别为003， 002， 005， 005， 003 μmol·L-1，化合物 1 的 IC50分别为（18±02）， （12±02）， （09±01）， （22±03）， （26±03） μmol·L-1，结果表明化合物 1 对所测试的人源肿瘤细胞增殖具有细胞毒活性。

[参考文献]

[1]吴征镒，陈书坤 云南植物志第8卷 [M] 北京： 科学出版社， 1997

[2]张蔷蓉 简述决明属中草药[J] 中草药， 2005， 36（6）： 955

[3]Li S F， Di Y T， Luo R H， et al Cycloartane triterpenoids from Cassia occidentalis [J] Planta Med， 2012， 78（8）： 821

[4]尹宏权，魏洁，尚贝贝，等 望江南化学成分分离和结构鉴定[J] 北京理工大学学报：自然科学版， 2013， 33（10）： 1098

[5]Yadava R N， Satnami D K Chemical constituents from Cassia occidentalis Linn [J] Indian J Chem B， 2011， 50（8）： 1112

[6]Zhang Y， Liu Y B， Li Y， et al Sesquiterpenes and alkaloids from the roots of Alangium chinense [J] J Nat Prod， 2013， 76（6）： 1058.

[7]Hu Q F， Zhou B， Ye Y Q， et al Cytotoxic deoxybenzoins and diphenylethylenes from Arundina Graminifolia [J] J Nat Prod， 2013， 76（10）： 1854

[責任编辑丁广治]