大鼠急性肝损伤（肝郁脾虚证）病证结合模型的研究

2017-04-07黄娜娜孙晓倩杨倩李晓宇

中国中药杂志 2016年23期

黄娜娜孙晓倩杨倩李晓宇

[摘要]建立適宜于抗急性肝损伤（肝郁脾虚证）中药复方活性发现、药效评价和新药研发的方证相应动物模型。依照中医病因病机演变规律和现代病理机制研究，抽提适宜于急性肝损伤（肝郁脾虚证）大鼠动物模型评价的证候、确定积分，根据药证相符原则选定逍遥丸和水飞蓟宾葡甲胺片为模型反证药物，大鼠每天腹腔注射猪血清，并按分组给予不同配比高脂低蛋白饲料及食用乙醇进行诱导；共7 d。实验期间每日观察大鼠的体重、食量、饮水量及一般观察并对其进行中医证候积分，实验结束检测大鼠血清ALT，AST，PA，TBIL，TBA等肝功能指标的水平，检查肝组织病理学变化。在造模1周后，各模型组的大鼠均达到明显急性肝损伤程度，且大鼠主证、次证均符合肝郁脾虚证的证候表现。与正常对照组比较，血清ALT和AST活性升高，TBIL和TBA含量升高，PA含量降低；肝组织病理形态学检查显示各模型组的大鼠均出现炎细胞浸润、嗜酸性变或嗜酸性脂肪变，反证药物组可不同程度改善上述病变表现。腹腔注射猪血清+高脂低蛋白饲料（895%玉米粉、10%猪油、05%胆固醇）+10%食用乙醇连续造模7 d，经药物反证，可建立拟临床肝郁脾虚证的急性肝损伤大鼠模型，具有成模耗时短、死亡率低、动物状态与临床患者证候表现相近等特点，可适用于抗急性肝损伤（肝郁脾虚证）中药复方活性发现、药效评价、新药研发和临床方证相关性研究与机制探讨。

[关键词]急性肝损伤；肝郁脾虚证；病证结合；大鼠；动物模型

Research on rat models of acute liver injury with syndrome of

liver depression and spleen deficiency

HUANG Nana1，2， SUN Xiaoqian2， YANG Qian3， LI Xiaoyu1， SUN Rong1*

（1 Shandong Academy of Chinese Medicine， Ji′nan 250014， China；

2 Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China；

3 Rizhao City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Rizhao 276800， China）

[Abstract]This paper aimed to establish animal models which are suitable for the activity found， efficacy evaluation of herbs resistant to acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency and new drug research and development based on corresponding of formula and syndrome The symptoms that are suitable for evaluating the rat models of acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency were extracted according to the evolution rule of the etiology and pathogenesis in traditional Chinese medicine and the modern pathological mechanism Xiaoyao pill and silibin meglumine tablets were used as drug counter evidence for models in accordence with the principle of consistence of prescription and syndrome Rats model were fed with highlipid and lowprotein fodder of different proportion and induced by intraperitoneal injection with pig serum， intragastric administration with edible alcohol once a day for 7 days Daily record of body weight， daily food intake and daily water intake were conducted day after day in experimental session Symptoms were also observed and evaluated by score at the same time The contents of ALT， AST， PA， TBIL and TBA in serum were detected and histopathological changes of liver were checked at the ending of experiment Obvious acute liver injury occurred to all rats in model groups at 1 week following model induction Both main symptoms and secondary symptoms were consistent with syndrome manifestation of liver depression and spleen deficiency Compared with normal control group， the activity of ALT，AST and contents of TBIL，TBA in serum increased and the content of PA decreased Liver tissue pathological morphology showed inflammatory cells infiltration， eosinophilic or eosinophilic adipose change in hepatocytes of rats in model groups All the above lesions manifestation could be improved by drug counterevidence By the disproof of medicine， rat models of acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency could be induced by fed with highlipid and lowprotein fodder which contained 895% cornstarch， 10% lard and 05% cholesterol， intraperitoneal injected with pig serum， intragastric administrated with edible alcohol for 7 days The rat models with a low mortality could be induced in a short time and animal status were similar to syndrome performance of patients So the rats models are suitable for the activity found， efficacy evaluation and drug discovery of herbs resistant to acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency， and also can be used in the research of correlation between prescription and syndrome and its mechanism

[Key words]acute liver injury； liver depression and spleen deficiency； combination of disease and syndrome； rat； animal model

doi：10.4268/cjcmm20162318

急性肝损伤主要是由病毒感染、药物服用不当、过量饮酒、高脂饮食因素造成的急性肝功能异常为代表的疾病。中医并无此病名，因黄疸贯穿于该病始终、且临床表现多势急病重，并多伴有神志昏蒙等证候，故中医多将其归为“急黄”范畴，多由饮食不节、饮酒、情志不遂等因素造成。随着现代生活方式的改变，鲁晓岚等[12]依据人群流行病学调查结果分析发现，长期饮酒并且饮食中碳水化合物、纤维素食物摄入较少，容易引起肝损伤。近年来研究证实[35]乙醇及饮食不当等因素已成为该病证主要诱因，中医药治疗急性肝损伤（肝郁脾虚证）疗效显著，引起国内外学者关注。

如何科学研究急性肝损伤（肝郁脾虚证）的现代中医病理机制、病程转归、疗效评价，如何快速、准确发现治疗急性肝损伤（肝郁脾虚证）的中药创新药物，都亟待构建一个适宜于急性肝损伤（肝郁脾虚证）现代中医药研究的病症结合模型。目前该领域研究主要应用西药药理学的四氯化碳、D氨基半乳糖、α柰基异硫氰酸酯、醋氨酚、异烟肼、四环素、刀豆球蛋白A、乙醇等单因素导致大、小鼠的急性肝损伤模型，或卡介苗+脂多糖、乙醇+高脂饲料、猪血清+四氯化碳+乙醇等多因素导致的急性肝损伤模型[6]，并无急性肝损伤（肝郁脾虚证）结合模型应用。

本研究在西医辨病、中医辨证、以病统证的基础上，借鉴了“从症辨证”的中医辨证思维，利用乙醇，高脂饲料及猪血清注射三者结合的复合诱发因素，模拟临床发病过程中“乙醇刺激”、“饮食不当”、“免疫损伤”等造成的体内多维度、多层级的病理损伤过程，同时根据中医对本病证的认知规律，遵循“正虚不能抗御外邪从而导致湿热毒邪入侵，由气入血，进而肝阻脾胃，脏腑功能失调，最后血脉受病，肝络瘀阻”的病机过程，通过对“乙醇刺激”、“饮食不当”、“免疫损伤”造模条件的优选，制备急性肝损伤（肝郁脾虚证）大鼠动物模型，以期得到一种适宜于中药复方活性发现、药效评价、新药研发和临床方证相关性研究的急性肝损伤（肝郁脾虚证）动物模型。

1材料

SPF级雄性Wistar大鼠100只，体重180～220 g，健康、适龄，购自山东大学实验动物中心，动物合格证号SYXK（鲁）20140001。实验动物配合饲料（鼠），生产许可证号SCXK（鲁）20140014。

水飞蓟宾葡甲胺片购自湖南千金协力药业有限公司（批号20140201），配制为质量浓度0010 8 kg·L-1的溶液。

逍遥丸购自河南省宛西制药股份有限公司（批号140109），配制为质量浓度1296 0 kg·L-1的溶液。

食用乙醇为市售红星二锅头，本实验用20%，10%乙醇由食用乙醇与蒸馏水稀释而成；胆固醇购自上海源聚生物科技有限公司；猪油为市售；猪血清购自上海忆欣生物科技有限公司，批号20141214。

丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），前白蛋白（PA），总胆红素（TBIL），总胆汁酸（TBA）等检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号分别为20140329，20140328，20140605，20140329，20140401。

PL303精密电子天平（瑞士梅特勒托利多仪器有限公司）；可调式移液器（上海赛默飞世尔仪器有限公司）；Multiskan Go1510全波长酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；TDZ5WS台式低速离心机[湘仪（湖南）离心机仪器有限公司]；DZKMS6电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；UV2600型紫外分光光度仪（中美合资尤尼柯有限公司）。

2方法

21适宜于动物模型评价的急性肝损伤（肝郁脾虚证）诊疗指标抽提目前公认的急性肝损伤诊断标准主要为乏力、食欲减退、恶心，体征表现为肝肿大并有压痛、肝区叩击痛，部分患者可有轻度脾肿大，血生化检查为ALT及AST活性升高[7]。公认的肝郁脾虚证诊断标准主要分为2部分[78]，主证：胁肋胀痛，食后腹胀或腹胀午后加重，倦怠乏力，食欲不振，大便稀溏或时溏时干；次证：恶心嗳气，烦躁易怒，时时太息，神疲懒言，舌质淡，脉弦或弦缓胁肋作痛、腹胀食少、情绪抑郁、便溏不爽，或腹痛欲便、泻后痛减、脉弦缓。而目前尚无公认的中医急性肝损伤（肝郁脾虚证）诊断标准。

本研究基于上述标准选择 ①症状和体征指标：主症，饮食、饮水减少，舌淡、腹胀、便溏；次症，精神不振，眼睛、耳廓和爪趾颜色变淡，毛色发黄，尾部有瘀斑，体重下降。拟建立大鼠证候积分评价量表（表1）。②肝脏病理组织学检查可见炎细胞浸润。③血清ALT，AST，TBA，TBIL水平升高，PA水平降低。④药物反证疗效显著。

22造模刺激条件的优化设计依据既往文献报道[6，910]不同乙醇浓度（10%～60%）灌胃不同天数可导致大鼠急性肝损伤模型，也有报道连续60 d用高脂低蛋白饮食喂养大鼠，会对正常大鼠肝脏造成明显的损害[11]。中医认为乙醇+饮食不当所致急性肝损伤为气、血、痰、湿相互搏结，其发病规律多为正虚不能抗御外邪从而导致湿热毒邪入侵，由气入血，进而肝阻脾胃，脏腑功能失调，最后血脉受病，肝络瘀阻。依据临床证候抽提分析，本研究以大鼠一般状况、血清ALT和AST水平、死亡情况等指标对复合因素中的高脂低蛋白饲料及乙醇配比（表2）进行优化比较研究。

23动物分组及给药雄性Wistar大鼠随机分成正常对照组、造模2和4组（见优化结果）、及其各自的水飞蓟宾葡甲胺片和逍遥丸药物反证组。2和4造模组及各自的药物反证组均按10 mL·kg-1体重给药，药物反证组分别给予0108 g·kg-1的水飞蓟宾葡甲胺片溶液和12960 g·kg-1的逍遥丸溶液，每日灌胃1次，共7 d；正常对照组饲以正常饲料和普通飲用水。

24观察指标与检测方法分别在第0，1，3，5，7天观察记录大鼠一般状况、症状体征情况及证候积分、体重、食水量、死亡情况。第8天大鼠眼眶静脉丛取血，3 500 r·min-1离心10 min，取血清，并按照相关试剂盒说明书的操作说明，用自动生化分析仪测定血清中ALT，AST，PA，TBIL，TBA等指标水平。取血后解剖去脑、肝、脾、胸腺组织并称重，计算脏器指数，一部分肝组织进行常规HE染色，光学显微镜下观察其组织形态学变化；另一部分肝组织-80 ℃保存。

25统计学方法采用SPSS 115统计软件，数据用±s表示，计量资料先进行正态检验，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料先转换成正态分布再用单因素方差分析。进行组间比较，P<005为数据统计有显著性差异。

3结果

31造模条件确认实验结果表明，除模型4组，其余3组大鼠均出现死亡，死亡率模型1组最高，ALT及AST值模型1组最大，模型4组最小，优化结果表现为模型4组大鼠最好，其次为模型2组，再次为模型3组，最差是模型1组（表3）。因此，为符合临床该病特点，本实验选择既有临床证候诊断指标，又有临床表现程度的2和4组作为模型组。

32造模对大鼠日食量及日水量的影响实验结果表明，模型2组与4组在给药后日食量与日水量均下降。与正常对照组比较，各模型组日食量在第7天差异显著（P<005）（表4）；日水量在第3天均出现了显著性差异（P<001），第7天复合因素模型组差异性极显著（P<0001）（表5）；食水量指标变化及药物反证结果提示，造模7 d动物出现急性肝损伤（肝郁脾虚证）的证候表现。

33造模对大鼠拟临床证候积分的影响实验期间，正常组大鼠一般活动正常，毛色光亮、眼睛有神，未见粪尿的异常改变。2个模型组呈现不同程度的大鼠行为倦怠、欠活泼，舌淡，腹部肿胀，耳廓和爪趾颜色变淡，毛色发黄，尾部少许瘀斑等；部分大鼠出现便溏现象，模型2组大鼠疾病情况最为严重，且出现死亡情况（图1）。模型2组、4组与正常组进行比较，其中医证候积分在第3天均出现显著性差异（P<005或P<001），到第7天复合因素模型组差异性极显著（P<0001）（表6）。证候积分变化及药物反证结果提示，造模7 d动物出现急性肝损伤（肝郁脾虚证）的证候表现。

34造模对大鼠体重的影响实验期间，正常对照组大鼠健康状况良好，灵活好动、反应敏捷、毛发光泽、饮食粪便正常、体重持续增加，无死亡；模型2组大鼠健康状况一般，较为慵懒，饮食粪便正常，体重持续增加，实验结束时死亡2只，第7天，与正常对照组比较，体重差异性极显著（P<0001）；模型4组大鼠健康状况一般，较为慵懒，饮食粪便正常，体重持续增加，无死亡，与正常对照组比较，无显著性差异（表7）。大鼠体重变化及药物反证结果提示，造模7 d动物出现急性肝损伤（肝郁脾虚证）的证候表现。

35造模对大鼠脏器系数的影响与正常对照组比较，其他各组的脏器系数均有不同程度的升高；模型2组大鼠出现肝脏肿大，肝系数升高，胸腺系数及脾系数升高，均呈现极显著的差异性（P<0001），模型4組也出现肝脏肿大，肝系数升高，胸腺系数及脾系数升高，具有显著性差异（P<001）（表8）。

36造模对大鼠血相关指标的影响正常组大鼠各血肝功指标水平均在正常范围内。与正常组比较，各模型组及阳性药组在给药后7 d血清ALT，AST，TBA，TBIL水平升高，PA水平降低；与模型2组比较，模型4组血清中ALT，TBIL水平偏低，具有显著性差异（P<005），AST水平偏低，具有显著性差异（P<005或P<001），而TBA和PA无显著性差异（表9）。

37造模对大鼠肝组织形态的影响造模对大鼠的肝脏组织Riddit分析病理分级结果显示，正常组肝小叶结构清晰完好，肝细胞未见明显变性、坏死，肝窦未见明显淤血扩张；模型2组部分肝细胞嗜酸性脂肪变，部分坏死，汇管区及间质慢性炎细胞浸润（P<0001），模型4组部分肝细胞嗜酸性变，汇管区慢性炎细胞浸润（P<001）（表10）。对用复合因素造模7 d后大鼠的肝组织病理改变进行观察（图2）。

4讨论

急性肝损伤最早由《内经》描述，如《素问·六元正气大论篇》载：“湿热相搏，民病黄瘅”，且《诸病源候论》的以下原文可证，“脾胃有热，谷气郁蒸，因为热毒所加，故猝然发黄”，“发汗不解，温毒气郁结在胃，小便为之不利，故变成黄，身如橘色”，“岭南中瘴气，土人连历不瘥，变成此病不须治也”，“黄病者，是热人脾胃，热气蕴积，与谷气相搏，蒸发于外，故皮肤系黄。—— 此或是伤寒，或时行，或瘟病，皆由热不时解，所以入胃也”。对上述认识归纳总结后主要表现为：毒邪是致病的基本因素，正虚是发病和邪气滞留的关键，血瘀是病证的主要特点[12]。本实验的造模方法中，致病因素乙醇属中医“湿毒”范畴，酒毒内侵、肝胆湿热；高脂属“血瘀”范畴，脾胃失调，肝胆不利；猪血清刺激属“本虚”范畴，素体正虚且感受湿邪，湿阻中焦，进而导致肝气郁滞，形成急性肝损伤（肝郁脾虚证）。

本研究在对急性肝损伤及肝郁脾虚证临床证候表现统计分析基础上制订中医证候积分评价量表，通过观察大鼠死亡情况、血清生化指标、肝组织病理情况，同时采用治疗肝郁脾虚证的经典名方逍遥丸及治疗急性肝损伤的常用药物水飞蓟宾葡甲胺片，经过中药及西药反证急性肝损伤（肝郁脾虚证）病证结合动物模型，观察药物改善指标变化的灵敏度，以确定模型建立成功与否。

结果显示，本研究建立的急性肝损伤（肝郁脾虚证）病证结合动物模型，体征变化情况与拟定诊断标准基本一致，肝脏病理学改变主要体现在肝细胞嗜酸性变，汇管区慢性炎细胞浸润，血中指标ALT，AST，TBA，TBIL水平升高和PA水平降低；模型2组死亡率达20%，药物反证组无死亡，而模型4组无死亡，药物反证组亦无死亡，可能与常规高脂低蛋白饲料中猪油含量过高有关，加之猪血清及乙醇的共同刺激，导致造模过度，引起大鼠死亡。与模型组比较，各药物反证组大鼠ALT，AST，TBA，TBIL水平降低，PA水平升高，肝组织中炎症反应减少，嗜酸性变降低，有统计学意义；比较两药物反证组的血相关指标值及病理变化程度，可发现逍遥丸组对模型的改善程度优于水飞蓟宾葡甲胺片组。通过上述分析结果，可发现优化后的模型4组成活率高、耗时短，且与临床上急性肝损伤（肝郁脾虚证）患者的发病原因，证候特点较为贴切，适用于该类药物的后期研究。

综上所述，本实验在考察高脂及乙醇2个因素对模型影响的基础上，通过优化高脂饲料配比，建立了一个成活率高、耗时短，且与临床急性肝损伤（肝郁脾虚证）典型证候变化相适应的大鼠模型，为后期应用于中药复方活性发现、药效评价、新药研发和临床方证相关性研究奠定基础。

[参考文献]

[1]鲁晓岚，陶明，罗金燕，等饮酒与肝病流行病学调查[J] 中华肝脏病杂志， 2002， 10（6）： 467

[2]梁卫酒精性肝病的中医辨证规律研究[D] 南京：南京中医药大学， 2013

[3]付田，蒲蔷，谭健，等栀子京尼平苷对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用[J] 中药药理与临床，2007，23（3）：25

[4]王向阳，叶珊珊，葛丽韭菜粗提物对保护酒精性肝损伤及辅助降血脂功能的影响[J] 中国食品学报， 2014 （1）： 28

[5]赵敏，郭娟，方步武，等蒿鳖养阴软坚方对大鼠酒精性肝损伤的预防作用[J] 时珍国医国药， 2010， 21（11）： 2887

[6]黄娜娜，孙蓉适宜于中药抗急性肝损伤活性发现与药效评价的动物模型应用概况[J] 中国药物警戒， 2015（11）：669

[7]郑筱萸中药新药临床研究指导原则[M]北京：中国医药科技出版社， 2002：144

[8]马玉平，王天芳，薛晓琳，等肝郁脾虚证的症状特点及辨证标准的现代文献研究[J] 中华中医药杂志， 2006， 21（2）：89

[9]洪汝涛，陈世林，阮海玲，等褪黑素对大鼠急性酒精性肝损伤的作用[J] 中国药理学通报， 2011， 27（11）：1596

[10]宋宁，王宪龄，李瑞琴柴胡黄芩配伍不同提取部位对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用[J] 中药药理与临床， 2006， 22（6）：8