菊苣提取物对高尿酸血症大鼠肾脏果糖转运体9表达的影响

王雨+林志健+聂安政+李丽玉+张冰

[摘要]该研究给予雄性SD大鼠10%果糖饮水建立高尿酸血症模型，将其分为正常组、模型组、苯溴马隆组（20 mg·kg^-1·d^-1）、菊苣提取物高、中、低剂量组（5，7.5，10 g·kg^-1·d^-1），连续42 d。分别测定血尿酸、血肌酐、尿素氮、尿尿酸，计算肾脏尿酸清除率；免疫组化法、逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法分别检测果糖转运体9（glucose transporter family member 9，Glut9）在大鼠肾脏的蛋白及基因的表达水平。探讨中药菊苣提取物降尿酸作用及对肾脏Glut9表达的影响。结果显示菊苣提取物能降低高尿酸血症大鼠血尿酸水平，增加肾脏尿酸清除率，降低肾脏Glut9的蛋白表达，抑制肾脏尿酸重吸收，从而促进肾脏尿酸排泄。

[关键词] 菊苣； 高尿酸血症； 果糖； 肾脏转运蛋白； Glut9

[Abstract] Sixty SD male rats were randomly divided into normal group， model group， benzbromarone group（20 mg·kg^-1·d^-1）， chicory extract high dose， middle dose and low dose groups （5， 7.5， 10 g·kg^-1·d^-1）. The rats in normal group were given with water， and the rats in other groups were given with 10% fructose solution to establish hyperuricemia models. All the rats were sacrificed on the 42th day. Then their serum uric acid（SUA）， serum creatinine（CRE）， urea nitrogen（BUN） and urinary uric acid（UUA） levels were detected to calculate the clearance rate of uric acid in kidney（CUA）. Meanwhile， the protein and gene expression levels of renal glucose transporter family member 9（Glut9） were detected by immunohistochemical and Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-qPCR） methods. The effects of Chinese herb chicory extract on expression of renal Glut9 and decreasing uric acid were explored in this study， and the results showed that chicory extract could reduce SUA level in rats with hyperuricemia， increase renal CUA， decrease the protein expression of renal Glut9， inhibit uric acid re-absorption in kidney， and thus promote renal uric acid excretion.

[Key words] chicory； hyperuricemia； fructose； renal transporter； Glut9

中药菊苣为菊科植物毛菊苣或菊苣的干燥地上部分或根，可清肝利胆，健胃消食，利尿消肿^[1]。高尿酸血症是血尿酸水平在体内持续性升高或血尿酸盐过饱和的一种病理状态，高尿酸血症不仅是痛风发生的主要病因，还是糖尿病、高血压、心血管疾病及代谢综合征的独立危险因素^[2-3]。本课题组长期从事菊苣防治高尿酸血症的研究，发现菊苣可稳定降低血尿酸水平，并从尿酸生成途径对其药效机制进行了探讨^[4-5]。尿酸生成过多与排泄障碍均会升高血尿酸水平，机体内66%尿酸由肾脏排泄，33%尿酸由肠道排泄。研究显示90%的高尿酸血症是由于肾脏对尿酸的重吸收增加和（或）分泌减少所致^[6]，肾脏中存在多种与尿酸相关的转运体，如果糖转运体Glut9（glucose transporter family member 9），有机阴离子转运体OAT1，OAT3（organic anion transporter 1，organic anion transporter 3）等，这些转运体通过影响肾小管对尿酸的重吸收或排泄从而改变肾脏的尿酸排泄。其中果糖转运体Glut9由SLC2A9编码，其基因多态性与尿酸生成及尿酸盐肾脏重吸收密切相关，全基因组学关联研究亦指出其与血尿酸水平变化相关^[7]。本研究从尿酸的肾脏排泄角度，切入肾脏转运蛋白Glut9，探讨中药菊苣降尿酸的药效机制。

1 材料

1.1 动物 雄性SD大鼠60只，体重（240±10） g，购于斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，动物合格证号SCXK（京）2011-0004。

1.2 药物及试剂 菊苣根购于新疆市场，由北京中医药大学中药学院黄建梅教授鉴定为菊苣Cichorii Herba。本课题组提取分离得菊苣地下部分水提取物（以下简称菊苣提取物）：菊苣药材粉碎浸泡，10倍水回流提取1 h后收集滤液，再8倍水回流提取1 h，合并滤液后浓缩。苯溴马隆片（德国赫曼大药厂，批号1208106）；D-果糖（美国AMRESCO公司，批号3573C350）；尿酸（serum uric acid，SUA）试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号151221）；肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（ureanitrogen，BUN）檢测试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所，批号20151218，20151230；Trizol（美国Ambion公司，批号94302）；氯仿、异丙醇等分析纯试剂均购于北京化工厂；6×RNA loading buffe，Glodview核酸染料，均购于博迈德生物科技有限公司，批号705685BB，705972BE；水合氯醛、琼脂糖（北京拜尔迪有限公司）；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美国赛默飞公司，批号00270373；Universal SYBR Green Supermix（美国Bio-Rad公司，批号730003407）；Anti-GLUT9 polyclonal antibody（美国Millipore公司，批号Q2361577）；兔超敏二步免疫组化试剂PV-9001，DAB显色试剂盒，抗体稀释液，均购于北京中杉金桥生物技术有限公司，批号K156617G，K165214C，16175A01。

1.3 仪器 Sunrise酶标仪（瑞士Teacan公司）；低温高速离心机（德国Sigma）；恒温水浴箱（北京医疗设备厂）；Quawell UV-Vis Spectrotometer Q5000（北京五洲东方科技发展有限公司）；CFX96 PCR仪（美国Bio-Rad公司）；FluorChem凝胶成像系统（香港安莱公司）；石蜡组织切片机（美国AO公司）；BX53显微镜，DP72CCD相机（日本奥林巴斯）；Imagine Pro-Plus 6.0圖像分析软件。

2 方法

2.1 动物分组及处理 SD大鼠适应性饲养5 d后，按体重随机分为正常组、模型组、苯溴马隆组、菊苣提取物高、中、低剂量组，每组10只。正常组给予清水，其余各组给予10%果糖饮水造模。正常组与模型组给予清水灌胃，苯溴马隆组给予20 mg·kg^-1苯溴马隆灌胃，菊苣提取物高、中、低剂量组分别给予相应的菊苣提取物灌胃（相当于生药量10，7.5，5 g·kg^-1·d^-1）。

2.2 相关指标检测 动物取血前禁食不禁水12 h，并称量体重，分别于实验的第10，20，30，40天尾尖取血，3 000 r·min^-1离心10 min，分离血清，检测血清尿酸（serum uric acid，SUA）、血清肌酐（creatinine，CRE）、血清尿素氮（urea nitrogen，BUN）。实验第40天，将动物放进代谢笼，禁食不禁水，收集24 h尿液，检测尿尿酸（urine uric acid，UUA）。计算尿酸清除率（CUA），CUA=UUA/SUA×每分钟尿量（mL·min^-1）。实验第42天，10%水合氯醛麻醉，处死动物取材。部分肾脏以4%多聚甲醛固定，用于制作组织石蜡切片，部分肾脏立即于-80 ℃保存，用于提取肾脏总mRNA。

2.3 免疫组化染色 4 μm组织石蜡切片60 ℃烤片1 h，常规脱蜡复水，PBS孵育3×5 min；0.01 mol·L^-1柠檬酸钠缓冲溶液水浴热修复30 min后冷却至室温，PBS孵育3×5 min；滴加3%H₂O₂，避光湿温孵育15 min，PBS孵育3×5 min；滴加一抗（1∶1 000稀释），湿盒内4 ℃孵育过夜；37 ℃复温孵育1 h，PBS孵育3×5 min；滴加PV-9001聚合物辅助剂，37 ℃湿温孵育1 h，PBS清洗3×5 min；滴加PV-9001辣根酶标记抗兔IgG聚合物，37 ℃湿温孵育1 h，PBS清洗3×5 min；滴加新鲜配制DAB工作液，显微镜下观察，棕色颗粒染色后PBS清洗3×5 min；乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性光学树脂封固，封片。

2.4 图像采集与分析 显微镜下采集图像，各组织切片选取5个互不重叠的视野，高速彩色CCD相机采集图像。以Imagine Pro-Plus 6.0图像分析系统进行免疫组化染色结果分析，测定阳性颗粒积分光密度IOD（inergral optical density），阳性表达面积Area。

2.5 提取RNA与合成cDNA RNA提取：取新鲜冻存的大鼠肾脏组织50～100 mg，于液氮中充分研磨至粉末状，置于无酶EP管中，加入1 mL Trizol，室温孵育5 min，加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温孵育3 min，于4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清500 μL置于新管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温孵育10 min，于4 ℃ 12 000×g离心15 min，弃上清，加入1 mL 4 ℃预冷75%乙醇，4 ℃ 7 500×g离心10 min，弃上清，空气干燥10 min，加入30 μL无酶水溶解，55 ℃水浴10 min。于波长260，280 nm下测定吸光度，计算A260/A280和肾脏总RNA浓度。1%琼脂糖凝胶电泳，180 V，15 min，观察肾脏总RNA完整性。cDNA合成：每个样本取4 μg总RNA作为模板按Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit步骤合成cDNA第一链。4 μg RNA模板，oligo（dt）181 μL，无酶水补足体积至12 μL，混匀，65 ℃孵育5 min，冰上骤冷，加入5×reaction buffer 4 μL，Ribolockrnase inhibitor 1 μL，10 mmol·L^-1NTP Mix 2 μL，Reveraid M-MVLV RT 1 μL，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min，终止反应。

2.6 Real-time RT-PCR检测Glut9 mRNA表达 用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，选用看家基因GAPDH为内参基因，由北京博迈德基因技术有限公司合成。Glut9 mRNA引物序列为：Forward 5′-TGCATTGGCGTGTTTTCTGG-3′，Reverse 5′-GTTTGGAAGGCTTTCGTGGC-3′；GAPDH引物序列为：Forward 5′-GGTGGACCTCATGGCCTACA-3′，Reverse 5′-ATTGTGAGGGAGATCCTCAGTGT-3′。

Real-time RT-PCR反应体系为20 μL，包含cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，Universal SYBR Green Supermix 10 μL，无酶水7 μL。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，40个循环；65～95 ℃，每5 s升高0.5 ℃进行溶解曲线分析。

2.7 统计处理 实验结果用SAS 9.0统计，数据均采用±s表示，多组间数据比较根据各组正态及方差齐与否选择单因素方差分析或是Kruskal-Wallis轶和检验，组间两两比较根据方差齐与否选择采用Dunnett-t检验或Dunnett′s T3检验，以P<0.05为差异有统计学意义。qPCR结果用2-ΔΔCt法统计，以相对值表示。

3 结果

3.1 动物一般状态 实验期间各组动物生长状态良好，体重逐渐增长且各组无组间差异。

3.2 大鼠血清尿酸水平變化 实验第10天至第40天，与正常组相比，模型组血尿酸水平均显著升高（P<0.01或P<0.05）；与模型组相比，苯溴马隆组血尿酸水平显著降低（P<0.05或P<0.01）；菊苣提取物高剂量组SUA水平显著降低（P<0.05或P<0.01）。实验第10天至第30天，菊苣提取物中剂量组血尿酸水平显著降低（P<0.01）；实验第20天，菊苣提取物低剂量组血尿酸水平显著降低（P<0.01），见表1。

3.3 大鼠肾功能指标 与正常组相比，实验第10天至第40天，模型组肌酐水平差异无显著性，尿素氮水平显著降低（P<0.01）；与模型组相比，实验期间其余各组肌酐、尿素氮水平差异无显著性，见表2。

3.4 肾脏尿酸排泄指标 实验第40天，各组尿尿酸无明显差异。与正常组相比，模型组24 h尿量显著减少（P<0.05），肾脏尿酸清除率无显著性差异；与模型组相比，菊苣提取物中剂量组24 h尿量显著增加（P<0.05），菊苣提取物高、中剂量组肾脏尿酸清除率显著增加（P<0.05），其余组无明显差异，见表3。

3.5 大鼠肾脏Glut9免疫组化染色及半定量分析 免疫组化染色结果见图1，Glut9在各组大鼠肾脏均有表达，主要表达于肾脏近曲小管顶膜。相较于正常组，模型组阳性表达面积与积分吸光度均显著增加（P<0.01）。相较于模型组，苯溴马隆组阳性表达面积显著减少（P<0.05），积分吸光度差异无统计学意义；菊苣提取物高、中、低剂量组阳性表达面积PEA与积分吸光度IOD均显著减少，见表4。

3.6 大鼠肾脏Glut9 mRNA表达的变化 提取的肾脏总RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳后紫外成像，清晰可见18S和28S条带，见图2。构建内参基因GAPDH和目的基因Glut9的标准曲线，得到斜率为-3.386，-3.338，其相关系数分别为0.998，0.997，计算得其扩增效率分别为97.4%，99.3%。Real-time RT-PCR结果显示内参基因GAPDH和目的基因Glut9扩增曲线呈“S”型，溶解曲线为尖锐单峰，扩增产物单一，引物特异性较好。

Real-time RT-PCR检测大鼠肾脏Glut9 mRNA相对表达量，用内参基因GAPDH归一目的基因Glut9的Ct值，相较于正常组，模型组Glut9 mRNA有上调趋势（P=0.102）；相较于模型组，苯溴马隆组与菊苣提取物高剂量组Glut9 mRNA有下调趋势（P=0.085，P=0.101），菊苣提取物中、低剂量组Glut9 mRNA表达未见明显改变，见图3。

4 讨论

4.1 果糖与高尿酸血症 高尿酸血症（HUA，hyperuricemia）是血尿酸水平在体内持续性升高或者血尿酸盐过饱和的一种病理状态，现代高尿酸血症患病率的增高与人民饮食结构的改变具有密切联系^[8]。果糖为己糖单糖，相关流行病学及临床研究表明果糖过量摄入可导致代谢综合征，其中，血清尿酸水平升高是其主要表现之一^[9-12]，近年来的相关动物实验与上述流行病学及临床研究具有一致性^[13-14]。本研究中给予大鼠10%高果糖饮水造模，实验第10～40天，与正常组相比，给予果糖造模组大鼠血尿酸水平持续稳定显著性升高。

果糖诱导高尿酸血症的病理机制可能与尿酸生成增加或排泄减少有关。有学者认为高果糖摄入引起高尿酸血症是由于果糖在肝脏迅速被转化为果糖-1-磷酸，从而刺激ATP水解增加腺嘌呤核糖核苷酸AMP，AMP在腺苷脱氨酶ADA的催化下生成次黄嘌呤核苷，并进一步在黄嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸^[15]。另有研究显示果糖诱导的血尿酸升高可能与调控肾脏尿酸分泌的有机阴离子转运体OAT，尿酸阴离子转运体UAT有关^[16]。此外，有研究认为高果糖的摄入可引起肾脏血液动力学以及排泄功能的改变^[17]。本研究显示，实验第40天，与正常相比，果糖造模组24 h尿量，UUA及CUA均无显著性差异，而在实验期间，果糖模型组血尿酸水平显著升高，表明其尿酸排泄量相对减少。同时本研究测定了肾脏功能相关指标，与正常组相比，果糖模型组CRE水平差异无显著性，BUN水平显著降低。CRE与BUN均为评价肾脏功能的指标，其中BUN为机体蛋白质代谢的终产物，果糖模型组大鼠BUN水平显著高于正常组，可能与其果糖饮水增多，饮食摄入减少有关，本研究结果不能说明存在肾脏功能损害。

4.2 Glut9促进肾脏尿酸重吸收，为促进肾脏尿酸排泄的药物作用靶点 尿酸生成过多与排泄减少均可使血尿酸水平升高，机体内2/3尿酸经由肾脏排泄，1/3经由肠道排泄^[18]，肾脏在尿酸排泄途径中有重要作用。肾脏的尿酸排泄主要包括肾小球滤过、肾小管和集合管重吸收以及重吸收后的再分泌，其中，肾小球滤过的尿酸约98%被肾小管重吸收^[19]。因此，肾小管的重吸收在肾脏的尿酸排泄过程中占重要地位。近年有研究显示，果糖转运体Glut9与SUA水平密切相关，是高通量、低能量的尿酸盐转运体^[20-21]。Glut9由基因SLC2A9编码，分为Glut9a和Glut9b 2个亚型，Glut9a由12个外显子编码，含540个氨基酸，表达于多个代谢器官，而Glut9b由13个外显子编码，含512个氨基酸，只在肝脏和肾脏中发现，并且肾小管是Glut9的主要表达场所，故Glut9是高尿酸血症的危险因子之一。

本研究中免疫组化染色显示Glut9在大鼠肾脏近曲小管顶膜表达，模型组Glut9蛋白表达水平显著高于正常组，表明其血尿酸升高可能与Glut9蛋白表达增加有关。相较于模型组，苯溴马隆组Glut9蛋白表达水平显著低于模型组，这与近年来研究发现的苯溴马隆可抑制Glut9，减少肾脏尿酸重吸收的报道一致^[22]，结合苯溴马隆组大鼠血尿酸水平显著低于模型组，表明抑制Glut9蛋白表达，减少肾脏尿酸重吸收，可作为促进肾脏尿酸排泄的药物作用靶点。

4.3 菊苣可能通过抑制肾脏Glut9表达，减少肾脏尿酸的重吸收发挥促尿酸排泄作用 中药菊苣为维吾尔族习用药材，具有清肝利胆，健胃消食，利尿消肿的功效，本课题组长期从事中药菊苣的研究，发现其可稳定的降低血尿酸水平。本研究显示，实验期间相较于模型组，各菊苣提取物组的血清尿酸水平均显著性降低，且存在一定的時效关系，这与本课题组前期研究结果一致^[23]。

本课题组前期从尿酸的生成途径对菊苣降尿酸的药效机制进行了研究，发现菊苣可改变尿酸合成过程中关键酶的活性来抑制尿酸的生成，从而起到降低血尿酸的作用，如黄嘌呤氧化酶、腺苷脱氨酶^[4-24]。相关研究表明，对肾脏尿酸转运蛋白的调控可能是传统中药及其有效成分发挥降尿酸作用的机制之一^[25]。本研究结果显示，与模型组相比，各菊苣提取物组大鼠CUA显著升高，表明菊苣提取物可能通过促进尿酸的肾脏排泄发挥降尿酸作用。尿酸水平的升高与肾脏Glut9过表达增加尿酸重吸收有关，本研究显示，苯溴马龙、菊苣提取物高、中、低剂量组可显著降低高尿酸血症大鼠肾脏Glut9蛋白的表达，有下调Glut9 mRNA表达的趋势，表明菊苣提取物可通过抑制Glut9的表达，从而减少肾小管对尿酸的重吸收，促进肾脏尿酸排泄发挥降尿酸作用，Glut9可能为菊苣提取物干预高尿酸血症的作用靶点。

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[责任编辑 张宁宁]