念珠菌感染光动力疗法的研究进展

覃金梅,黄力毅

(广西医科大学第一附属医院·广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁530021)

念珠菌感染光动力疗法的研究进展

覃金梅,黄力毅

(广西医科大学第一附属医院·广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁530021)

随着广谱抗生素的广泛应用，器官移植、免疫抑制治疗及HIV感染病例的增多，真菌感染的发病率不断增高。念珠菌是真菌相关性感染最常见的病原体，目前临床上治疗念珠菌感染仍以传统抗真菌药为主，但是由于临床上预防性及反复治疗的用药，导致耐药现象日益严重。光动力疗法是指光敏剂在特定波长的光源照射下，发生激化引起一系列级联反应产生大量活性氧物种导致靶细胞发生不可逆损伤的新型治疗方法。针对念珠菌常用的光敏剂主要有卟啉类、吩噻嗪类、酞菁类。目前体外试验、动物实验及临床研究均证实，PDT可以杀灭白色念珠菌。

光动力疗法；念珠菌；光敏剂

真菌感染是较常见的临床问题，真菌相关性感染的病原体以念珠菌属最常见。念珠菌属是机会性致病菌，常寄生在人体的口腔、皮肤、肠道黏膜及阴道等部位。当宿主免疫力低下或寄居处微环境发生改变，则易导致浅表性或全身系统性感染。目前抗念珠菌感染在临床上仍以唑类抗真菌药为主，同时予以多烯类、丙烯胺类及棘球白素类等辅助。然而由于预防性及大量反复用药，耐药问题日益凸显。光动力疗法(PDT)是指利用特定波长的光源照射光敏剂，使其发生激化，引起一系列光学级联反应产生大量活性氧物种从而导致靶细胞不可逆损伤的一种治疗手段。以往常用于治疗肿瘤疾病，直到近年来随着感染、真菌及细菌耐药问题的日益严重，越来越多的学者开始重新评估PDT在抗感染治疗中的价值。本文从作用机制、常用光敏剂、体外研究、动物研究及临床研究等方面对PDT在抗念珠菌感染领域的研究进展进行综述。

1 PDT抗念珠菌的作用机制

PDT的机制是通过局部或全身给予光敏剂，光敏剂优先聚集于分裂生长较旺盛的细胞或组织，经过一段时间孵育，光敏剂选择性地富集于病变部位。光敏剂吸收一定能量的光以后，产生电子激发态，由基态经激发单重态系间窜跃快速生成激发三重态，此时光敏剂可通过两种类型的反应产生损害作用。Ⅰ型反应中，光敏剂直接与底物或溶剂发生氢或电子的转移，形成自由基或自由基离子，这些自由基又与氧进一步反应产生超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等。Ⅱ型反应则是三重态光敏剂直接转移能量给氧，生成单重态氧，这是一种高反应活性的氧化剂，具有亲电性，能高效氧化不饱和脂肪酸、蛋白质、核酸和线粒体膜等生物分子。在两种反应中，这些活性氧的产生量决定着靶体损伤程度。而在不同的光敏剂、光照、底物等反应条件下，活性氧的产量也不同，因此寻求合适的反应条件至关重要。

2 抗念珠菌的光敏剂

光敏剂是光动力效力的重要决定因素之一，目前针对念珠菌常用的光敏剂主要有卟啉类、吩噻嗪类、酞菁类。

2.1 卟啉类衍生物 卟啉类衍生物多为在第一代光敏剂的血卟啉结构基础上进一步优化而来，主要分为内源性和外源性两大类。内源性卟啉典型代表为5-氨基酮戊酸(5-ALA)，5-ALA不具备光敏性，参与血红素的合成。靶细胞特异性吸收5-ALA，通过酶促反应生成的原卟啉Ⅸ发挥光敏效应[1]。5-ALA已被美国FDA认证应用于临床，其甲基酯化合物在多个国家和地区已被批准用于基底细胞癌和光化性角化病的临床治疗，5-ALA具有的抗真菌性逐渐引起研究者们的注意。外源性卟啉主要包括二氢卟吩、叶绿素和卟啉等。其中，卟啉化合物中的血卟啉单甲醚(HMME)是属于我国首创的一种单体卟啉新型光敏剂，具有光敏化力强、毒性低、有效成分明确等优点，有较好的应用前景。而在癌症中应用较广的具有特异性聚集特性的血卟啉衍生物-Photogem®对念珠菌也有很好的灭活作用。

2.2 吩噻嗪类 吩噻嗪类药物是吩噻嗪的衍生物，是一种三环结构化合物，因侧链结构不同而分为三类，目前临床上多将其作为精神类药物使用。作为抗念珠菌的光敏剂该类复合物最常用的是亚甲蓝(MB)、新亚甲蓝、甲苯胺蓝和二甲基蓝(DMMB)。李庆妮等[2]比较了4种吩噻嗪类光敏剂，发现DMMB的抗念珠菌作用最强，这可能与光敏剂的亲脂性有关，不过其对正常组织的较强光毒性导致了应用的局限性。

2.3 酞菁类 酞菁是一类具有大分子共轭体系，由4个异吲哚组成的稠环化合物，最大吸收光谱位于670～780 nm可见光区，主要富集于细胞线粒体。酞菁类染料具有分子结构易修饰的特点，新兴的高效酞菁类化合物通过引入中心金属原子及取代基团使最大吸收光谱红移，引入磺酸基等强极性基团或者结合纳米载体提高自身溶解性。目前硅酞菁Pc4的相关实验报道较多，Pc4是疏水性光敏剂，Pc4利用聚乙二醇树状大分子作为药物递送载体，可以促进Pc的水溶性和防止非特异性吸收，对念珠菌起到了更强的杀灭效力[3]。

3 PDT抗念珠菌的体外研究

目前体外试验证实，PDT的灭菌率与一定范围内的光敏剂浓度具有正相关性，当光敏剂达到合适的浓度时基本可以完全杀灭白色念珠菌[4]。Mima等[5]利用假牙模型，以Photogem®作为光敏剂分析比较了白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌及克柔念珠菌对PDT的敏感性，结果发现热带念珠菌、克柔念珠菌对PDT的敏感性较为突出，都柏林念珠菌敏感性最低，但较基线仍降低了1.73个log。念珠菌各种菌型对PDT的敏感性可能会因光敏剂的不同而发生变化，但造成这种现象的具体机制目前尚未明确。PDT对念珠菌各菌型的敏感性与抗生素的敏感性不同与二者作用机制有关。大部分传统灭菌药物的主要抑制真菌细胞膜中麦角固醇的合成，而PDT中的受光激发产生的ROS不仅对真菌壁及细胞膜具有渗透性，一旦进入细胞实质内还可以直接损伤细胞器，增加磷脂酰丝氨酸的外部化和DNA的断裂导致细胞死亡[6]。有相关文献[4,7]发现，PDT对念珠菌丝、孢子及生物膜等均有抑制作用。生物膜是由菌体细胞外基质形成的立体结构菌落，是菌体躲避药物及机体防御系统的重要屏障，生物膜内白色念珠菌对氟康唑的耐药性是浮游菌的1 000多倍[8]。De Figueiredo Freitas等[9，10]证实了PDT具有抑制白色念珠菌生物膜的效果。不过研究者们普遍认为，PDT对生物膜中的念珠菌的杀伤力比一般浮游菌差。Gonzales等[11]发现,0.5 μmol/L双阳离子卟啉XF-73孵育15 min用12 J/cm2的蓝光照射即可使白色念珠浮游菌活力下降超过6个log，而对于生物膜，则必须用更高浓度的1 μmol/L XF-73孵育4 h结合48.2 J/cm2蓝光才可以杀灭超过5个log的细胞。这与生物膜的结构特点是密不可分的。生物膜代谢活性高，结构致密，其内靶细胞含量多，排列紧凑[10]。有学者建议重复应用PDT，延长孵育时间、光照时间及增加光敏剂的浓度可提高PDT对生物膜的抗菌活性[10,13]。Cernáková等[12]研究表明，PDT可以抑制对卡泊芬净不敏感的近平滑念珠菌的生物膜生长。另有研究者[13]发现，对耐药菌的杀伤力与光剂量呈依赖性关系，研究者们推测耐药性并不是一个影响PDT疗效的因素，白色念珠菌的酵母型与菌丝状两种形态的比例可能起着关键作用。目前体外研究证实，PDT杀灭念珠菌的方式是多途径、多位点的，对不同菌型及形态都具有明确的体外杀伤作用，同时对传统抗真菌药物不敏感或耐药的念珠菌亦有较大的灭活力，然而PDT是否在机体环境下是否有着同样效果仍需进一步的动物水平研究。

4 PDT抗念珠菌的动物研究

念珠菌广泛存在于人体的口腔、皮肤、黏膜等部位，一旦机体免疫系统失调念珠菌过度生长则可导致不同的疾病。Carmello等[14]利用免疫功能抑制的小鼠诱导口腔念珠菌感染模型，以100 mg/L的二氢卟吩e6衍生物-Photodithazine®(PDZ)孵育20 min，在波长660 nm，光照能量37.5 J/cm2的激光照射，与制霉菌素1 000 IU治疗的作为阳性对照组进行比较，结果发现治疗24 h后二者菌落失活较基线下降分别为3和3.2个log，7 d后PDT治疗组较制霉菌素组患处治疗效果明显，达到了完全缓解。同时在试验中观察发现PDT对小鼠的炎症介质反应有一定的影响。有学者[15]认为这种由PDT引发的短暂性TNF-α升高预示着机体清除坏死细胞，加速了组织恢复。这与肉眼观察到的PDT组的口腔炎症的快速缓解趋势相一致。PDT可以减轻念珠菌感染伴发的炎症反应，在小鼠其他部位感染的研究中同样得到证实。Machado-de-Sena等[16]以1 mmol/L的MB配合红光对感染白色念珠菌阴道炎的小鼠进行PDT干预，不仅能有效减少念珠菌生长的菌落数，而且经过两次PDT治疗后感染处的炎性细胞明显减低，这可能与第1次PDT治疗后残余的念珠菌毒力因子减少有关。女性阴道炎的临床症状主要源自炎症反应本身而非真菌感染，光动力杀灭真菌的同时能减轻炎症反应，这对于促进PDT 进一步应用到临床中十分有意义。动物模型研究表明，PDT对口腔、皮肤、黏膜等不同部位的念珠菌感染均有较好的疗效，并可能会减轻全身炎症反应，且对宿主组织细胞无损害作用，这为进一步的临床应用提供了相对坚实的理论依据。

5 PDT抗念珠菌的临床研究

目前PDT抗念珠菌感染的研究多集中于体外及动物水平阶段，临床试验的研究仍较少，文献报道的临床研究基本为念珠菌感染的口腔疾病。邱海霞等[17]研究表明PDT可以有效治疗食管白色念珠菌感染。Scwingel等[18]发现，以MB为光敏剂的PDT能有效治疗HIV感染者并发的口腔念珠病，比传统抗真菌药具有更长效的灭菌力。研究显示，从HIV感染者中分离得到的白色念珠菌株的蛋白酶、磷脂酶和黏附力等毒力因子较正常菌株的表达更强，而HIV感染者免疫系统缺陷也更容易造成念珠菌的反复感染，PDT多途径的化学杀伤作用对于较强毒性念珠菌的反复感染似乎是一个很好的解决办法。不过由于PDT一般采用局部用药有可能也会因为接触面不完全而影响后期的疗效。Mima等[19]以Photogem®介导的PDT和制霉菌素治疗念珠菌导致的义齿性口炎，有效率分别为45%和53%，研究者们推测PDT组中有效率较低的原因可能是因为颊膜、舌背等口腔其他地方的白色念珠菌迁移到经过PDT治疗后的上颚部重新繁殖。现有的临床研究表明，经过PDT治疗的念珠菌感染复发率更低，不过临床治愈率仍受诸多因素影响，目前临床研究中应用的光敏剂及浓度、治疗时间和光照参数等都比较单一，而这些影响因素在体外研究对念珠菌的灭活力有着至关重要的作用，因此将来的临床试验对相关因素进行更多的尝试寻求最适当的PDT参数条件对提高临床治愈率十分必要。

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黃力毅(E-mail:liyi175@163.com)

2017-09-07)