NK细胞对非小细胞肺癌细胞NCI-H292的杀伤作用及对其β-catenin蛋白表达的影响

杨永辉，李辉，郭素敏，李秀武，尹江凡，赵鹏，高莉,吴树才

(1河北省胸科医院·河北省肺癌防治研究中心，河北石家庄 050041；2 河北师范大学生命科学学院)

NK细胞对非小细胞肺癌细胞NCI-H292的杀伤作用及对其β-catenin蛋白表达的影响

杨永辉1，李辉1，郭素敏1，李秀武1，尹江凡2，赵鹏2，高莉2,吴树才1

(1河北省胸科医院·河北省肺癌防治研究中心，河北石家庄 050041；2 河北师范大学生命科学学院)

目的探讨自然杀伤(NK)细胞对肺癌细胞系NCI-H292的杀伤作用及对癌细胞中β-catenin蛋白表达的影响。方法无菌采集健康人外周血，培养NK细胞(NK组)，取培养14 d后的NK细胞，调整细胞浓度为5×106/mL，按1∶5的比例接种到NCI-H292细胞(NK+NCI-H292 组)培养板共培养24 h，单独培养NCI-H292细胞(NCI-H292组)24 h。采用CCK-8法测算NK细胞对肺癌细胞系NCI-H292的杀伤活性，采用Western blotting法检测NCI-H292细胞中β-catenin蛋白的表达。结果NK细胞对NCI-H292细胞的杀伤率为96.720%±1.081%，与NK及NCI-H292组比较，NK+NCI-H292组β-catenin表达降低(P均<0.01)。结论NK细胞对NCI-H292细胞具有杀伤力，同时能够抑制NCI-H292细胞中β-catenin蛋白的表达。

肺癌；NCI-H292细胞；自然杀伤细胞； Wnt/β-catenin信号通路;β-catenin蛋白

肺癌，又称支气管肺癌，发病率及病死率居癌症之最[1]。肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中，NSCLC的发病率占总肺癌发病率的80%～90%[2～5]。肺癌患者确诊时多是晚期，错过治疗的最好时期。虽然手术切除是目前治疗该病的主要手段，但术后癌症易复发、转移。传统治疗药物缺乏组织特异性，虽起到一定疗效，但不良作用很大。目前国内外权威性较高的第三代铂类药物与新药共同治疗，总生存率仅上升4.2%[6，7]。鉴于该病高危害性致使人类不断探索新的治疗手段，生物治疗[8]的出现使肺癌治疗提升到一个新的平台。2015年1月～2016年1月，本实验探讨了NK细胞对肺腺癌细胞系NCI-H292的杀伤作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人类非小细胞肺癌NCI-H292细胞由中国科学院上海细胞库提供；NK细胞为本实验室自制；1640细胞培养基(RPMI-1640)购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技责任有限公司；粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素2(IL-2) 购自Peprotech公司；抗人CD3单抗购自武汉生物制品研究所；SDS蛋白裂解液及BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天公司；β-catenin多克隆抗体购自Abcam公司；β-actin多克隆抗体购自晶美公司。流式细胞仪购自德国BD公司，CO2培养箱购自美国Themro公司， MK3 酶标仪购自美国Thermo公司，蛋白转印系统购自美国Bio-rad公司。

1.2 外周血单个核细胞(PBMC)的分离及培养 在37 ℃、5% CO2培养箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养NCI-H292细胞，每天使用倒置显微镜观察细胞生长情况，换液，细胞长满培养瓶后进行1/2传代培养。无菌、静脉采集28岁健康志愿者外周血，用EDTA抗凝，Ficoll密度梯度离心法分离外周血，获得PBMC细胞，以无血清的PRMI-1640培养基悬浮沉淀细胞，调整细胞浓度到5×106/mL，细胞移入6孔板中，3 mL/孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中贴壁3 h后，轻摇培养板，贴壁细胞去掉，未贴壁细胞用来培养NK细胞。

1.3 分组及处理 在上述未贴壁细胞中加入细胞因子IL-2(2 500 U/mL)、IL-15(1 000 U/mL)、IL-4、GSF(10 ng/mL)、RPMI-1640的培养基培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，隔天换液，并及时补充细胞因子培养NK细胞。取对数生长期的NCI-H292细胞，计数，制成细胞悬液。将细胞分为NK组(将诱导的NK细胞单独培养24 h)、NK+NCI-H292 组(取培养14 d后的NK细胞，调整细胞浓度为5×106/mL，按1∶5的比例接种到NCI-H292细胞培养板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中共培养24 h)、NCI-H292组(单独培养NCI-H292细胞24 h)，每组细胞的接种浓度相同。

1.4 NK细胞作用后NCI-H292细胞增殖活力的检测 采用CCK-8 法。在96孔板中配制细胞悬液100 μL。将培养板在培养箱预培养24 h(37 ℃，5% CO2)。向培养板加入不同浓度的实验组、对照组细胞10 μL。将培养板在培养箱孵育20 h。向每孔加入CCK8溶液10 μL 。 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(A值)。在各组细胞培养20 h时加入CCK-8，在细胞培养24 h时，用酶标仪测492 nm处的A值，并计算杀伤活性。计算公式：杀伤率(%)=[A(加NK细胞) -A(空白)]/[A(不加NK细胞)-A(空白)]×100。

1.5 NCI-H292细胞中β-catenin蛋白表达的检测 采用Western blotting法。SDS裂解液裂解共培养的细胞，提取细胞总蛋白，测蛋白浓度，分装蛋白，-20 ℃保存，计算上样量。取60 μg蛋白上样，电泳，转膜，封闭2 h，加入一抗，4 ℃过夜，洗膜，加入二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜，加化学发光液，进行显影。化学发光剂显色后，蛋白凝胶成像系统分析样品中目标蛋白的相对含量。

2 结果

2.1 细胞形态学表现 NCI-H292细胞聚集生长，细胞呈不规则形态。PBMC在培养箱中培养14 d，培养过程中，在细胞因子的刺激作用下，细胞个头小，亮且圆，分布均匀，一段时间后，可见部分单个核细胞明显分化扩增为NK细胞，形成细胞团，培养第6天倒置显微镜观察可见细胞增殖明显，呈集落状分布。培养第14天，可见细胞呈圆球状，细胞核大且圆。

2.2 各组NCI-H292细胞增殖活力比较 NK、NK+NCI-H292、NCI-H292组细胞A值分别为2.629±0.071、3.018±0.114、3.937±0.202，NK+NCI-H292组A值低于NCI-H292组(P<0.05)。NK对NCI-H292细胞的杀伤率为96.720%±1.081%。

2.3 各组细胞中β-catenin蛋白表达比较 NK、NCI-H292、NK+NCI-H292组β-catenin蛋白相对表达量分别为0.515±0.039、0.481±0.031、0.136±0.027，与NK及NCI-H292组比较，NK+NCI-H292组β-catenin表达降低(P均<0.01)。

3 讨论

NK细胞是大淋巴细胞，平均直径为12～15 μm，胞质较多，具有肾形核结构，在胞质内有许多大小不等的嗜天青颗粒，故又称大颗粒淋巴细胞，核呈卵圆形。NK细胞不需抗原激活，更不需抗体的协助，可直接杀伤靶细胞，例如杀伤被病毒感染的细胞和肿瘤细胞，且这种抗感染和抗肿瘤的杀伤作用是广谱的，属于天然免疫系统的重要细胞组成成分，具有免疫监视和免疫清除功能[9，10]。70年代初NCI的研究人员在研究T细胞对靶细胞的特异杀伤时发现，正常对照小鼠的脾细胞可以象免疫小鼠的脾细胞一样杀伤某些肿瘤细胞。由于这些被发现的细胞并不需要致敏或者提前免疫就会出现杀伤功能，因而取名为天然杀伤细胞[11，12]。NK细胞由骨髓造血干细胞发育形成，在骨髓中产生与分化，成熟后被释放到血液中，占单个核细胞的5%～10%，其除能直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞外，也可通过ADCC效应发挥杀伤作用。主要生物学作用包括4个方面：非特异性杀伤肿瘤细胞，是机体免疫监视系统中的一个重要组成部分；抗病毒感染；参与抗骨髓移植和移植物抗宿主反应；参与免疫调节，NK细胞本身能够产生IFNγ和IL-2等淋巴因子，对机体的免疫应答具有一定的调节作用。

Wnt信号通路是一条能够调控细胞增殖、分化的信号通路，涉及个体发育，细胞增殖、分化、凋亡和坏死等多个方面。β-catenin是Wnt信号通路的核心蛋白成分[13]。在Maria等[14]建立的小鼠模型实验中，激活的Wnt信号增加了肿瘤的概率。大量研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌、大肠癌、非小细胞肺癌等肿瘤中均异常表达。Wnt信号通路的活性与β-catenin有关。Mazieres等[15]研究发现，在肺癌的发生发展中，Wnt/β-catenin信号通路中Wnt蛋白(Wnt-1、Wnt-2)表达上调，Wnt对抗物WIF-1、DKK转录终止，进一步研究表明，β-catenin在包括肺癌在内的多种实体瘤细胞中高表达。

本试验通过Ficoll密度梯度离心法分离健康志愿者PBMC，加入不同的细胞因子体外诱导NK细胞，与肺腺癌细胞NCI-H292联合培养后测细胞凋亡率和细胞内β-catenin的表达情况，结果发现，1∶5的比例混合共培养后，NK能够杀伤NCI-H292细胞，杀伤率为96.72%±1.081%。与NK及NCI-H292组比较，NK+NCI-H292组β-catenin表达降低。提示NK细胞可能通过下调Wnt信号通路从而促进肺癌细胞的凋亡，为肺癌患者的免疫疗法提供了一定的理论依据。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.010

R734.2

A

1002-266X(2017)45-0033-03

河北省省级重大医学研究课题(ZD2013063)。

吴树才(E-mail:freebirdgo@163.com)

2017-02-23)