缺氧相关microRNA在窒息死亡原因推断中的意义

曾颜，马剑龙，陈龙

（复旦大学上海医学院法医学系，上海 200032）

·综述·

缺氧相关microRNA在窒息死亡原因推断中的意义

曾颜，马剑龙，陈龙

（复旦大学上海医学院法医学系，上海 200032）

在缺氧条件下microRNA（miRNA）能与转录因子等相互作用，调节细胞代谢，血管再生，血细胞生成，细胞增殖、分化及凋亡等生理过程，这些过程可能在窒息导致的死亡中发挥重要作用。本文拟对缺氧条件下miRNA的调节功能及缺氧对miRNA生物合成的影响进行综述，以期为miRNA在法医学窒息死亡原因推断中的研究提供新思路。

法医病理学；窒息；综述；microRNA；缺氧；死亡原因

microRNA（miRNA）是生物体内合成的长度约为22个核苷酸的非编码RNA，通过与靶基因mRNA 3′-非翻译区（untranslated regions，UTR）互补结合，促进靶基因mRNA的降解或抑制其翻译，在转录后水平调控基因表达，广泛参与细胞包括缺氧在内的生理过程[1]。

2007年第一个缺氧相关miRNA-210被发现[2]，随后越来越多的研究表明，缺氧会影响miRNA的表达，这些miRNA也会参与缺氧相关基因转录后水平的调节。本文拟对缺氧影响miRNA生物合成及缺氧条件下miRNA的功能进行综述，以期为miRNA在缺氧条件下的基础研究及其在法医学上推断窒息死亡的研究提供新思路。

1 机体缺氧状态与窒息

缺氧是指由高海拔、贫血或异常不充分的血液供给等生理或病理因素引起的组织中氧分压低于正常生理水平［3.2～8.8kPa（24～66mmHg）］的状态[3]。氧气与二氧化碳在呼吸系统的气体交换是维持人生命活动必不可少的过程，如果有机械性外力破坏这种交换，就会产生呼吸障碍、缺氧、二氧化碳滞留，最终导致机体组织器官功能衰竭而死亡。窒息的发生、发展是一个连续的过程，全身呼吸系统、神经系统、血液循环及肌肉等均受到损害，窒息前期机体内剩余氧气可维持生命活动；随着缺氧程度逐渐加深，由于得不到氧气供给而出现意识丧失，肌肉痉挛，最终呼吸心搏停止而死亡[4]。Höckel等[5]发现，当氧分压为1.3～2.0 kPa（10～15 mmHg）时，缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）可调节多种基因的表达，如碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9，CA9）、葡萄糖转运子1（glucose transporter 1，GLUT1）等；当氧分压低于1.3 kPa（10 mmHg）时，腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的合成降低，相关蛋白质合成减少，细胞进入低耗氧量状态；当氧分压低于0.13 kPa（1 mmHg）时，氧化磷酸化水平降低，细胞进入糖酵解的代谢途径，甚至引发细胞凋亡。这些在不同缺氧水平下的生理过程可能参与窒息死亡的不同阶段，可为寻找窒息死亡原因标志物提供依据。

研究[6]发现，在缺氧条件下，HIF调控细胞代谢，血管再生，血细胞生成，细胞增殖、分化及凋亡等生理过程，是最主要的缺氧调控因子。HIF由对氧分压敏感的α亚基（HIF-α）和稳定的β亚基（HIF-β）组成。在常氧条件下，HIF-α的氧依赖降解结构域（oxygendependent degradation domain，ODDD）在脯氨酰基羟基化蛋白及von Hippel-Lindau（VHL）蛋白的作用下，经泛素化降解途径被26S蛋白酶体降解；在缺氧条件下，这一降解作用被抑制，HIF-α在细胞质中积累，转位至细胞核与HIF-β形成复合体，在miRNA及转录因子等调控因子作用下，与基因启动子区的缺氧反应元件（hypoxia response elements，HRE）作用，调控下游缺氧相关基因包括miRNA的表达[7]。

除HIF依赖途径，机体存在内质网应激和非折叠蛋白反应（unfolding protein response，UPR）、mTOR、P53等非HIF依赖途径。在缺氧时，蛋白质错误折叠，在内质网中积累，引起内质网UPR[8]；mTOR能调节细胞Caspase依赖的蛋白质的翻译过程，缺氧诱导磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）-哺乳动物西罗莫司靶体蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号转导通路（PI3K-AKT-mTOR），抑制mTOR活性，抑制mRNA翻译，诱导细胞自噬[9]；在缺氧时，鼠双微体基因2（murine doubleminute 2，MDM2）表达量降低、MDMX E3泛素配体磷酸化、Rad3相关蛋白共济失调、毛细血管扩张等均在P53的激活与稳定中发挥重要作用，调控细胞凋亡[10]。这些HIF非依赖途径也在缺氧条件下miRNA的生物合成及其功能中发挥重要作用。

2 miRNA在缺氧中的研究进展

2.1 缺氧对miRNA生物合成及活性的影响

miRNA的生物合成首先由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录pri-miRNA，Drosha作用于pri-miRNA形成PremiRNA，然后由Exportin5转运至细胞质，在Dicer酶作用下形成22bp的双链，最终有义链形成成熟单链miRNA并与Ago2等蛋白质形成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。研究[11]表明，缺氧影响miRNA生物合成的各个阶段：在转录起始阶段，HIF与启动子区的HRE作用诱导许多miRNA（包括mir-103、mir-210、mir-213、mir-181、mir-26、mir-24-1等）的合成，而非HIF依赖的转录因子NF-κB在缺氧条件下被激活从而调节mir-146a、mir-155、mir-21、mir-210及mir-424等的合成，P53在缺氧条件下影响mir-210、mir-107及mir-192等的合成；在转录后加工阶段，缺氧抑制Drosha、Dicer等蛋白的表达，从而影响mir-21、mir-22、mir30c及let7f等在细胞中的含量；缺氧影响参与miRNA生物过程的蛋白质的转录后修饰，如Wu等[12]研究发现，缺氧提高C-P4H（Ⅰ）酶的表达，促进Ago2蛋白脯氨酰基羟基化而积累Ago2蛋白，影响RISC的形成。研究表明，缺氧参与内含子的选择性剪切[13]、RNA序列A-I碱基的编辑[14]，这些发现可为缺氧调节miRNA的研究提供新思路。

2.2 miRNA在缺氧中的功能

在缺氧时，miRNA的转录后调控机制可通过HIF依赖的途径及HIF非依赖途径，调节糖酵解、线粒体呼吸、细胞周期进程、DNA修复、细胞凋亡、血管再生、红细胞生成等生理过程，使机体精确、快速地应对急性缺氧或局部缺氧。

许多miRNA可促进HIF的表达或提高其活性，经HIF依赖途径应对缺氧。如mir-210靶向调节甘油-3-磷酸脱氢酶1而稳定HIF-1α[15]；在血管内皮细胞中，缺氧诱导mir-424的表达，靶向调节cullin2而稳定HIF-α[16]；mir-20b[17]及mir-155[18]能直接抑制HIF-α转录本。此外，miRNA也可经HIF非依赖途径应对缺氧，如mir-210通过调节COX蛋白及铁硫蛋白组装等抑制线粒体呼吸，通过靶向作用E2F3而影响细胞周期进程[4，19，20]；mir-146a，b在缺氧条件下调节肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TARF6）及细胞介素1受体相关激酶（interleukin-1 receptor associated kinases，IRAK1），抑制NF-κB介导的炎症反应[21]；mir-181c在缺氧条件下能靶向调节神经细胞TNF-α mRNA而促进细胞凋亡[22]。

2.3 miRNA在窒息死亡原因推断中的意义

法医学实践中通常根据颜面部发绀、内部器官淤血、血液暗红色流动性及玫瑰齿等非特异性征象，结合案情分析及案发现场侦查判断窒息死亡，但在某些案情不明、案发现场遭到破坏、尸体检验未发现明显机械性外力作用致损伤痕迹的情况下，往往难以确定是否为窒息死亡。以往关于窒息的研究多采用大鼠、家兔等动物窒息死亡模型，研究血液pH值变化、血气分析[23]及血液离子浓度改变[24]等，但受血液成分复杂性及死后环境因素等的影响，这些研究结果很难用于法医学鉴定实践。此外，也有学者通过分子生物学手段，利用动物模型，从蛋白质和mRNA水平检测iNOS、HIF等基因表达改变，以期为窒息死亡原因的推断提供辅助指标[25，26]，但由于人体样本一般都已经过一定的死亡时间，蛋白质等分子均发生不同程度的降解，单纯利用蛋白和mRNA表达量来推测死亡原因存在明显的局限性。而miRNA由于其本身片段小，死亡后的降解速度比mRNA慢，将弥补蛋白和mRNA的局限性，更适合作为窒息死亡原因推断的标志物。因此筛选窒息特异性miRNA标志物对于法医学实践具有重要意义。

当氧供应不足或利用氧障碍时，组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化，脑、心等生命重要器官缺氧是导致机体死亡的重要原因。此外，心脏有心包保护，受外界环境因素影响相对较小，脑组织有颅腔的保护且几乎没有核酶，RNA的稳定性较好。因此筛选窒息死亡原因推断miRNA标志物，可优先选择心脏及脑组织进行研究。大量研究发现，心脏缺氧会引起miRNA表达量的改变，如在急性心肌梗死中，缺氧相关的mir-155及P53调节的mir-192、mir-34a等表达上调[27]；抑制缺氧相关mir-29b能显著提高Colla1，2及Col3al的表达[28]，在抑制心肌肥大中可能发挥作用；mir-21通过靶向调节Spry1、PDCD4抗凋亡、PTEN加强Akt信号通路及PPARα改变脂质代谢等在心肌细胞病理重塑过程中发挥重要作用[29]。在缺血缺氧性脑损伤研究中，研究者通过新生大鼠缺血缺氧性脑损伤模型、大脑中动脉栓塞模型、缺血缺氧再灌注模型、全脑缺血缺氧模型等不同的缺血缺氧性脑损伤模型，发现缺氧相关miRNA在缺血缺氧性脑损伤中发挥重要作用。如在大鼠局灶性脑缺血7d后，mir-124a在脑室管膜下区神经祖细胞中表达下调[30]；mir-181在大鼠大脑中动脉栓塞模型梗死区表达量升高，抑制葡萄糖调节蛋白GRP78的表达，促进细胞凋亡[31]；在氧气及葡萄糖缺乏的小鼠脑组织中，mir-15a表达上调，抑制bcl-2/-w蛋白的表达，促进细胞凋亡[32]。

2013年，Cecchi等[33]已运用人体样本就HIF作为窒息标志物的可能性进行了相关研究，而当前miRNA与缺氧的研究进展特别是与HIF的相互调控，为其成为窒息特异性标志物提供了可能。通过上文所述，mir-210作为最早发现的缺氧相关miRNA[2]，在缺氧中的研究最为深入透彻，其在缺氧时通过HIF依赖途径[15]及非依赖途径[19，20]广泛参与机体各器官组织的调控，很可能成为窒息标志物；mir-124a是脑组织中表达丰度最高的一类miRNA，在不同缺血缺氧脑损伤研究中其表达量均发生改变，参与中枢神经系统增殖分化过程的调控，可能成窒息死亡原因推断的稳定指标。但在法医学鉴定实践中受取材部位、年龄及性别差异等因素的影响，筛选窒息特异性标志物仍有待大量实验的验证。

3 展望

miRNA通过HIF依赖途径及非依赖途径调控多种缺氧反应过程，为研究miRNA在窒息死亡中的作用，从分子水平更深入地阐释窒息所引起的缺氧导致机体死亡的机制提供了线索。此外，研究人员已经发现许多在缺氧时含量或活性发生改变的miRNA，为进一步筛选窒息特异性标志物提供了依据，而标志物的筛选有助于在某些情况下（如案情不明、案发现场遭破坏、尸体检验缺少能导致缺氧窒息的机械性外力作用的损伤痕迹时）判定死亡原因是否为窒息。当然，窒息特异性miRNA的筛选还需要大量实验来验证，利用miRNA标志物进行窒息死亡原因的推断作为一种新的方法，应用于人尸体方面仍需要进一步研究。

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Significance of Hypoxia-related microRNA for Estimating the Cause of Mechanical Asphyxia Death

ZENG Yan,MA Jian-long,CHEN Long
（Department of Forensic Medicine,Shanghai Medical College,Fudan University,Shanghai 200032,China）

Under hypoxia condition,microRNA（miRNA）can interact with transcription factors for regulating the cell metabolism,angiogenesis,erythropoiesis,cellular proliferation,differentiation and apoptosis. The biological processes above may play an important role in mechanical asphyxia death.This article reviews the regulating function of miRNA under hypoxia condition and the influence of hypoxia to biosynthesis of miRNA,which may provide some new ideas to the research of miRNA on determining the cause of mechanical asphyxia death in the field of forensic medicine.

forensic pathology;asphyxia;review;microRNA;anoxia;cause of death

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.010

1004-5619（2017）01-0038-04

2015-06-16）

（本文编辑：邹冬华）

国家自然科学基金资助项目（81373242）

曾颜（1992—），女，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：14211010070@fudan.edu.cn

陈龙，男，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事法医病理学及法医临床学研究；E-mail：chenlong@shmu.edu.cn