肥大性下橄榄核变性分子遗传学研究进展

冯佳梁, 周 慧, 沈佐廷, 李 飞, 张社卿

(1. 上海市第二军医大学附属长海医院 神经内科, 上海, 200433;2. 上海市杨浦区市东医院 神经内科, 上海, 200433)

综 述

肥大性下橄榄核变性分子遗传学研究进展

冯佳梁1,2, 周 慧2, 沈佐廷2, 李 飞2, 张社卿1

(1. 上海市第二军医大学附属长海医院 神经内科, 上海, 200433;2. 上海市杨浦区市东医院 神经内科, 上海, 200433)

肥大性下橄榄核变性; 基因诊断; POLG基因; SURF1基因; SCA1型基因; 研究进展

肥大性下橄榄核变性(HOD)是一种临床少见的神经系统变性疾病，临床特点为在原发病变稳定后出现头晕、视物不清、眼震、腭肌阵挛、肢体震颤、共济失调等表现，其中上腭震颤为其典型症状，通常在格莫三角损伤后数周至数月出现，约5～24周症状达到高峰。原发脑损伤疾病已经给患者带来很多痛苦[1], 而HOD这一继发病症的出现又再次加重了躯体损伤，增加了患者精神及经济负担，因此，如何早期诊断并有效干预成为临床研究热点。研究[2-4]表明，线粒体缺陷与神经系统疾病的发生密切相关，如帕金森综合征、Alpers综合征、进行性眼外肌麻痹等，而HOD属于神经系统疾病的一种，有国外学者研究[5-6]发现，外显子测序鉴定提示纯合子致病P-W748 POLG突变，SURF1基因突变与其发生也密切相关，因此，从基因角度对HOD发病时基因的反应模式进行诊断可以避免影像学检查的滞后性，有助于为其早期诊断提供更多的帮助。本文对基因诊断HOD的研究进展进行综述，为其早期诊断、及早干预提供依据。

1 肥大性下橄榄核变性候选基因

1.1 POLG基因

线粒体是普遍存在于真核细胞的半自主性细胞器，是氧化磷酸化的场所，线粒体的生物活动依赖于线粒体DNA编码的蛋白的表达，线粒体DNA 是由16 569个碱基对组成的双链裸露的超螺旋闭合共价环状DNA分子, DNA聚合酶γ(pol γ)多肽位于线粒体内膜内侧，由1 239个氨基酸组成的杂合二聚体，分子长度为139.5 KDa, 包括140 kDa的催化亚基及55 kDa的调节亚基，具有促进pol γ与DNA双链的紧密结合启动DNA复制的功能，其是线粒体中唯一起聚合酶作用的酶，在线粒体DNA的复制及修复中发挥重要作用[7-8]。催化亚基是由线粒体 DNA 特异性聚合酶 G(POLG)基因编码, POLG基因位于15号染色体，包含10个连串的编码谷氨酰胺的CAG密码子的CAG-三核苷酸重复多态性参与神经细胞凋亡的过程，当POLG基因发生CAG-三核苷酸重复长度的突变后，线粒体DNA比率超过阈值，会使得DNA聚合酶γ的校正功能丧失，造成线粒体DNA的点突变、缺失和多发缺失以及含量的减少，线粒体不能提供足够的能量，细胞正常的氧化磷酸化功能受到阻碍，促进反应性产物的产生，进而导致易感性神经变性疾病[9-10]。目前, POLG基因突变导致的神经系统疾病包括感觉性共济失调、少年型脊髓小脑共济失调、癫痫综合征、进行性眼外肌麻痹、阿尔茨海默病等，而肥大性下橄榄核变性属于神经系统变性疾病的一种，病变主要累及小脑、脑干，出现神经元变性，临床表现出现震颤、共济失调等，与感觉性共济失调、少年型脊髓小脑共济失调等相似。有国外学者研究[11]发现，干扰素治疗丙肝后出现耳聋、嗜睡，口齿不清，步态不稳，查体水平眼震，共济失调步态，末梢感觉消失，无腭肌阵挛, MRI提示双侧肥大性下橄榄核变性，外显子测序鉴定提示纯合子致病P-W748 POLG突变。基因突变分为纯合子及杂合子突变，而POLG基因的16号外显子上存在2492位点A→G的杂合突变与肥大性下橄榄核变性发生相关。

1.2 SURF1基因

线粒体DNA 包含编码氧化磷酸化呼吸链复合体必需的13个多肽，线粒体呼吸链相关蛋白由核基因和线粒体基因共同编码，呼吸链氧化磷酸化亚基基因共有 92 个，线粒体基因仅编码其中的13 种，剩余79个均由核基因编码[12]。线粒体呼吸链由5种酶复合物组成，呼吸链复合物IV即细胞色素C氧化酶，存在于真核生物细胞的线粒体内膜上，由13个多肽亚单位组成，其中3个由线粒体基因编码，其余均由核基因编码，在细胞呼吸中处于细胞色素系统的末端，通过氧化磷酸化为细胞提供能量[13-14]。当编码氧化磷酸化系统中蛋白质的核基因发生致病性突变时，导致相关呼吸链酶功能丧失或降低，引起线粒体组装或功能障碍，线粒体蛋白合成障碍和呼吸链组分和功能异常，使能量消耗很大的神经系统出现功能障碍和组织坏死[15-16]。呼吸链复合物亚基及组装因子突变属于核基因突变的一种，人SURF1蛋白的第25～299位氨基酸构成的肽链形成SURF1家族，含有300个氨基酸残基，有两个跨膜结构域，参与调节细胞色素C氧化酶复合物的组装以及维持其正常活性，人类SURF1基因包含9个外显子，位于9q34.2, 基因组序列全长4695 bp, 具有进化上的保守性，从原核到真核生物都发现有SURF1基因的同源序列。人类SURF1基因异常，如604G→C突变导致的SURF1蛋白第202位氨基酸残基由酸性天冬氨酸转变为碱性组氨酸，或者574C→G的颠换为杂合性的错义突变导致的第192位氨基酸由碱性的精氨酸变为中性的甘氨酸，会导致细胞色素C氧化酶功能缺陷，细胞色素C氧化酶功能缺陷影响ATP生成，均可直接或者间接对神经通路造成影响，累及中枢神经系统，特别是脑，出现视力障碍、构音障碍、吞咽困难、上肢共济失调、站立及行走困难等症状[17-18]。

1.3 SCA1型基因

脊髓小脑共济失调(SCA)基因共定位28种致病基因, 7种为基因编码区CAG-三核苷酸重复扩增突变，导致编码产生的多聚谷氨酰胺异常集聚，导致表现为共济失调、步态不稳、言语不清、构音障碍、眼球震颤等症状的橄榄脑桥小脑萎缩的发生，由于橄榄脑桥小脑萎缩与肥大性下橄榄核变性的病变均主要累及小脑、脑干，出现神经元变性，临床表现也颇为相似，因此部分学者[19-20]认为橄榄脑桥小脑萎缩与肥大性下橄榄核变性的发病机制存在一定的共性。SCA1位于染色体6q22～23, 基因组跨度450 kb, cDNA长11kb, 含有9个外显子，编码816个氨基酸残基组成ataxia-1蛋白，该蛋白位于细胞核，橄榄脑桥小脑萎缩患者第8号外显子发生CAG突变后其重复扩增的拷贝数为40～83, 正常人为6～38[21-22]。SCA2 型基因定位在染色体12q23～q24.1上，正常等位基因含有 17～29 个 CAG-三核苷酸重复和1～3 个 CAA 重复，橄榄脑桥小脑萎缩患者5′端外显子 1 编码区发生CAG突变后其重复扩增的拷贝数为37～63。CA3型基因定位在染色体14q32.1, 正常人 CAG 重复 13～36 次，橄榄脑桥小脑萎缩患者重复 68～79次。

2 肥大性下橄榄核变性基因诊断相关技术

随着分子遗传学及基因学的发展，基因诊断因其特异性强、可操作性强，已成为临床科研的热点，目前，根据是否对致病基因本身进行检查分为两类，一类是采用利用 PCR 扩增产物或者邻近的 DNA 序列作为探针的直接基因诊断，另一类是遗传连锁分析的间接基因诊断[23]。肥大性下橄榄核变性常继发于脑梗死、中毒、手术及外伤、肿瘤、血管畸形、脑出血等导致的格莫三角损伤的脑部疾病，是由于神经传导在这个三角通路中阻断，所发生的一种独特的跨突触神经变性，导致传入细胞的突触丢失，这种特异性的变性在原发病变后一段时期发生顺行性空泡变性，导致受影响的下橄榄核部位的神经元体积增大，随着时间的推移，肥大逐渐减轻，随后又出现细胞萎缩，因此，临床上将其归于线粒体障碍性疾病，多采用直接基因诊断对治病基因进行检测[24]。首先采用PCR-RFLP技术，取正常人群作为对照，选择基因引物，如POLG基因正向引物为5′-ACAGTGTTGGGGACGCAG-3′, 反向引物为5′-CCTCGCCAGGCATCTCC-3′; SURF1基因引物: 正向引物为5′-TGGCTCCATGTCAGTGTTGT-3′, 反向引物为5′-AGGGCTCTGCTGTTGAACTC-3′扩增所有研究对象候选基因全部外显子后, PCR扩增产物经HinfⅠ酶切获得不同长度、大小、数量的限制性酶切片段，酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并采用末端终止法进行测序检测单碱基替代以及小片段核苷酸的插入或缺失，迅速而准确的解读基因突变信息[25]。

3 展 望

1887年Oppenheim首次报道肥大性下橄榄核变性，通过尸检发现了下橄榄核增大的特征性病理改变。1931年, Guillain和Mollaret描述了小脑齿状核与对侧的红核和下橄榄核构成的等边三角传导通路，也称之为格莫三角，正如Guillain和Mollaret所描述的，在格莫三角中的神经元联系着对侧小脑的齿状核、同侧中脑的红核、同侧延髓的下橄榄核，由齿状核发出的神经纤维通过小脑上脚传入对侧的红核，途中与小脑臂发生交互作用，红核发出的神经纤维通过中央被盖束传入下橄榄核。下橄榄核发出神经纤维通过小脑下脚联系对侧的齿状核，当损伤位于红核或中央被盖束时，常会导致同侧的橄榄核肥大变性，当损伤位于小脑上脚或齿状核时，常会导致对侧的橄榄核肥大变性，如果同时损伤到红核或中央被盖束以及齿状核及小脑上脚时，常会导致双侧的肥大性下橄榄核变性。

肥大性下橄榄核变性临床特点为在原发病变稳定后出现头晕、视物不清、眼震、腭肌阵挛、肢体震颤、共济失调等表现，典型症状为上腭震颤，其为软腭有节奏的连续的运动，有时累及其他颅神经或脊神经支配的肌肉，但是肥大性下橄榄核变性临床表现与遗传性脊髓小脑共济失调、橄榄脑桥小脑萎缩等神经系统疾病表现相似，无法根据临床症状对其进行诊断。影像学检查发现，肥大性下橄榄核变性患者在MRI上有非常特征的影像学表现，在原发病损伤1月后, MRI在T2WI上通常会出现下橄榄核高信号征，并持续数年，原发损伤约半年后出现下橄榄核肥大，并持续3～4年，随后出现萎缩，在下橄榄核肥大阶段, MRI上表现为延髓腹外侧局限性T2WI长信号结节灶，轮廓呈蛋形，称之为蛋形征，是诊断此病的重要依据[26-28], 但是影像学检查具有滞后性，不适合用于对其进行早期诊断。当前的研究[29]发现, POLG基因的突变将会影响DNA聚合酶γ的复制, Surfeit人1蛋白(SURF1)基因突变导致细胞色素C氧化酶缺陷，候选基因的突变均会造成线粒体能量生成障碍，使神经系统疾病发生的危险性会明显增加，因此，在脑梗死、中毒、手术及外伤、肿瘤、血管畸形、脑出血等脑损伤发生后对患者基因进行检测，有助于预测肥大性下橄榄核变性是否发生，进而对其进行早期诊断。但是，基因诊断应用于肥大性下橄榄核变性仍具有以下不足: ①基因诊断应用于肥大性下橄榄核变性容易受医务工作人员素质、社会支持度等多种因素影响。②由于国内外的基因诊断应用于肥大性下橄榄核变性的研究报道仍较少，导致候选基因种类较少。

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2017-01-20

张社卿

R 714.14

A

1672-2353(2017)15-227-03

10.7619/jcmp.201715082