TLR2、SIRT6、MMP-9在胎膜早破患者胎膜组织中的表达变化及其相关性

宋春红，甄娟，杨蓉娟，毕学杰 (石家庄市第四医院，石家庄050011)

TLR2、SIRT6、MMP-9在胎膜早破患者胎膜组织中的表达变化及其相关性

宋春红，甄娟，杨蓉娟，毕学杰
(石家庄市第四医院，石家庄050011)

目的 观察胎膜早破(PROM)患者胎膜组织Toll样受体2(TLR2)、沉默配型信息调节蛋白6(SIRT6)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达变化，并探讨三者间的相关性。方法 选择足月胎膜早破(tPROM)患者20例(tPROM组)，未足月胎膜早破(pPROM)患者20例(pPROM组)，正常晚期妊娠妇女20例(正常对照组)，免疫组化法检测各组胎膜组织TLR2、SIRT6与MMP-9表达部位，Western blotting法检测各组胎膜组织TLR2、SIRT6与MMP-9蛋白表达水平，并分析三者的相关性。结果 与正常对照组比较，tPROM及pPROM组胎膜组织中TLR2及MMP-9的表达高(P均<0.01)，SIRT6的表达低(P<0.01)，三者在tPROM组与pPROM组的表达比较，P均>0.05。在胎膜组织中，TLR2与MMP-9的表达呈正相关(r=0.64，P<0.05)，SIRT6与MMP-9的表达呈负相关(r=-0.55,P<0.05)。结论 PROM患者中，TLR2及MMP-9表达水平升高、SIRT6表达水平降低，TLR2与MMP-9的表达正相关，SIRT6与MMP-9的表达负相关。

胎膜早破；基质金属蛋白酶9；沉默配型信息调节蛋白6；Toll样受体2

胎膜早破(PROM)指胎膜在临产前自发性破裂，严重影响母婴健康。以妊娠是否满37足周为界，可分为足月胎膜早破(tPROM)和未足月胎膜早破(pPROM)。宫内感染是造成PROM的重要机制之一。Toll样受体(TLR)家族属于IL-1R/TLR超家族，与免疫炎症相关。在天然免疫反应中不仅可以清除病原体，而且可以通过识别病原相关模式分子过程而激活获得性免疫系统。沉默配型信息调节蛋白6(SIRT6)在维持基因组和端粒的稳定性、调控炎性反应等方面发挥重要作用。基质金属蛋白酶(MMP)的激活在PROM中发挥了重要作用，MMP-9对胎膜细胞外基质的异常降解是PROM发生的中心环节。MMP-9的生成受自分泌和旁分泌调节。在胎膜组织中，TLR2、SIRT6与MMP表达关系的研究较少。本研究检测了TLR2、SIRT6及MMP-9在PROM患者胎膜组织中的表达，并探讨了三者的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1～12月因PROM在石家庄市第四医院住院并以剖宫产结束妊娠妇女40例，患者均符合全国高等学校教材《妇产科学》第7版[1]中胎膜早破的诊断标准。其中足月胎膜早破(tPROM组)20例，年龄(28.3±2.6)岁，孕周(38.5±2.9)周；未足月胎膜早破(pPROM组)20例，年龄(27.2±3.0)岁，孕周(31.3±2.7)周；选择行剖宫产终止妊娠的正常晚期妊娠妇女20例为正常对照组，年龄(27.9±3.1)岁，孕周(38.1±2.6)周。各组无其他母体疾病、产科并发症等，无吸烟、酗酒、吸毒等不良生活史，剖宫产指征为胎位异常、骨盆狭窄等。

1.2 标本制备 胎盘娩出后，于无菌条件下取胎膜破口处胎膜组织5～10 g，其中一部分吸干水分后放入高压灭菌处理的EP管中，投入液氮保存，备用；另一部分置于10%中性甲醛固定24～48 h后常规石蜡包埋、切片、烤片，切片厚度5 μm，进行TLR2、SIRT6及MMP-9免疫组化染色，另外一张作为阴性对照。

1.3 胎膜组织中TLR2、SIRT6及MMP-9表达检测 ①免疫组化法检测TLR2、SIRT6及MMP-9在胎膜组织中的表达部位。石蜡切片常规脱蜡、水化；柠檬酸缓冲液中微波加热修复抗原，PBS冲洗；滴加3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性，室温20 min，PBS冲洗；血清封闭室温20 min；滴加一抗(TLR2 1∶300，SIRT6 1∶50，MMP-9 1∶300)，4 ℃过夜，PBS冲洗；滴加试剂盒中增强剂，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗；滴加二抗，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗；苏木素复染，水冲洗，盐酸乙醇分化，1%氨水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照以PBS代替一抗。以出现棕黄色颗粒为阳性，观察与背景染色一致或无明显着色为阴性。②Western blotting法检测TLR2、SIRT6及MMP-9蛋白表达水平。提取胎膜匀浆蛋白，以BCA法定量后，将各组浓度调到同一水平，制备10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，每孔蛋白样品60 μg，电泳分离蛋白，转膜，封闭，洗膜，加入一抗(TLR2 1∶900, SIRT6 1∶300, MMP-9 1∶1 000)，4 ℃过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜。化学发光法检测杂交蛋白表达，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。扫描图像，进行蛋白峰面积灰度分析，以β-actin为内参照对待测样本进行蛋白半定量分析。

2 结果

2.1 TLR2、SIRT6及MMP-9在PROM患者胎膜组织中的表达部位 免疫组化结果显示，在胎膜组织，TLR2主要表达于羊膜细胞、蜕膜细胞和绒毛膜滋养细胞膜；MMP-9主要表达于羊膜细胞、蜕膜细胞、绒毛膜滋养细胞及中性粒细胞质；SIRT6主要表达于羊膜细胞、蜕膜细胞及绒毛膜滋养细胞核。

2.2 TLR2、SIRT6及MMP-9在PROM患者胎膜组织中的表达水平 Western blotting结果显示，tPROM组、pPROM组及正常对照组TLR2蛋白相对表达水平分别为0.98±0.15、1.05±0.17、0.54±0.11，MMP-9蛋白表达相对水平分别为1.28±0.16、1.31±0.19、0.97±0.22，SIRT6蛋白表达相对水平分别为0.60±0.14、0.57±0.14、0.96±0.20。tPROM及pPROM组胎膜组织中TLR2及MMP-9的表达高于正常对照组(P均<0.01)，tPROM组、pPROM组胎膜组织中TLR2及MMP-9表达水平相比，P均>0.05。tPROM及pPROM组胎膜组织中SIRT6表达水平低于正常对照组(P均<0.01)，tPROM组、pPROM组胎膜组织中SIRT6表达水平比较，P>0.05。

2.3 胎膜组织中TLR2、SIRT6及MMP-9表达的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，在胎膜组织中，TLR2与MMP-9的表达呈正相关(r=0.64，P<0.05)，SIRT6与MMP-9的表达呈负相关(r=-0.55，P<0.05)。

3 讨论

胎膜是胎儿的附属物之一，由绒毛膜及羊膜组成。完整的胎膜能够使羊膜腔内保持一定的羊水量从而保护母胎安全，并可阻挡阴道病原微生物上行性感染，维持羊膜腔的无菌环境。PROM为产科常见并发症，其发病是多因素、多途径共同作用的结果。研究表明，感染与炎症为PROM发生的主要原因[2,3]，且与PROM互为因果。慢性及急性炎症可以导致自分泌和旁分泌失衡和细胞因子释放，炎性因子和炎性抑制因子失衡导致胎膜脆性增加、宫颈成熟扩张引起分娩。MMP对胎膜细胞外基质的异常降解是PROM发生的中心环节[4]。MMP表达调节有多种途径，TLR2激活可以促进炎性反应，SIRT6有抗炎作用，本研究重点阐述了PROM患者胎膜组织中TLR2、SIRT6与MMP-9的表达及其相互关系。

胎膜含有丰富的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原和蛋白多糖等细胞外基质，细胞外基质的结构与功能对维持羊膜的抗张性起着至关重要作用。MMP-9作为MMPs家族中重要的一员，以酶原的形式分泌，被激活后，形成Ⅳ型胶原酶，降解、破坏细胞外基质的Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶[5]。MMP-9升高不仅见于正常分娩胎盘的羊膜，也见于早产患者的羊膜中。羊膜上皮细胞可产生MMP-9，在刺激因素作用下，MMP-9可以促进基底膜降解，导致细胞凋亡及分离[6]。MMP-9表达主要在转录水平调节，炎性细胞因子和内毒素可以激活转录因子NF-κB诱导MMP-9表达[7,8]。本研究结果表明，MMP-9广泛表达于胎膜羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞、蜕膜细胞及中性粒细胞，在PROM患者，MMP-9表达升高，从而水解胎膜细胞外基质，导致胎膜脆性增加，发生PROM。

TLR2是与免疫及炎性反应关系最为密切的TLR家族成员。TLR2位于细胞表面，属Ⅰ型跨膜蛋白，包括富含亮氨酸重复序列的膜外区、跨膜区和含有Toll/IL-1R同源区结构域的胞质区。TLR2具有相对广泛的配体特异性，包括细菌来源的外源性配体和宿主来源的内源性配体，它能特异性识别革兰阳性菌成分，包括脂磷壁酸，与TLR1和TLR6协同构成异源二聚体可以识别LPS。TLR2与胞外病原体相关分子模式或有害内源性物质结合被激活后，通过髓样分化因子88依赖性途径，激活MAPK及NF-κB途径，导致前炎性细胞因子释放。如前所述，炎性细胞因子可以诱导MMP-9生成。在人表皮角质形成细胞，TLR2被配体激活后，可以激活JNK和p38 MAPK，并可以诱导IκB-α降解和NF-κB核转位，呈剂量依赖性诱导MMP-9 mRNA和蛋白表达。本研究表明，在PROM胎膜组织中，TLR2与MMP-9表达升高，两者呈正相关，表明TLR2可能通过直接或间接作用促进MMP-9表达。

SIRT6是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的组蛋白去乙酰化酶，与转录因子NF-κB的核心亚基RelA直接接触，使RelA调控靶基因启动子部位的H3K9去乙酰化，以致RelA与染色质结合不稳定，最终终止NF-κB信号的转录调控作用，抑制靶基因表达，从而发挥抗炎作用。在子宫肌层、胎膜等组织中，NF-κB转录激活炎症因子IL-6、IL-8、TNF及前列腺素过氧化物合成酶2，最终导致MMP-9和前列腺素产生，而后两者是发动分娩的重要因子。在羊膜细胞中，SIRT6过表达可以降低NF-κB活性，导致炎性分子和分娩启动因子转录降低。本试验研究显示，在PROM组，SIRT6表达降低，MMP-9表达升高，两者呈负相关，其可能机制为在PROM患者，SIRT6表达降低，对NF-κB的转录抑制功能降低，MMP-9表达升高。

综上所述，在PROM胎膜组织中，TLR2与MMP-9表达升高，SIRT6表达水平降低；TLR2与MMP-9表达呈正相关，SIRT6与MMP-9表达呈负相关，表明炎性因子及炎性抑制因子失衡，从而导致MMP-9表达升高在PROM中发挥重要作用，为PROM的预防和治疗提供了新的靶点；结合文献，NF-κB可能是连接其中的关键分子，需要在细胞学中进一步研究证实。

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