ELF5基因对人卵巢癌细胞侵袭转移和大鼠移植瘤生长的抑制作用及其机制

邱玲琳，闫洪超(徐州医科大学研究生院,江苏徐州 000；徐州医科大学附属医院)

ELF5基因对人卵巢癌细胞侵袭转移和大鼠移植瘤生长的抑制作用及其机制

邱玲琳1，闫洪超2
(1徐州医科大学研究生院,江苏徐州 221000；2徐州医科大学附属医院)

目的 探讨ELF5基因对人卵巢癌细胞侵袭转移和大鼠移植瘤生长的抑制作用以及可能的机制。方法 体外实验：人卵巢癌细胞随机分为重组质粒组、空质粒组、未经转染组，重组质粒组、空质粒组分别转染构建好的pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核表达载体、空载质粒pcDNA3.1-EGFP，未经转染组未经任何转染。Q-PCR法检测各组ELF5 mRNA的相对表达量，Western blotting法检测基质金属蛋白酶MMP-2及MMP- 9蛋白的相对表达量；Traswell试验评价ELF5对卵巢癌细胞侵袭转移的影响。体内试验：建立人卵巢癌NOD/SCID鼠左前肢腋下移植瘤模型，应用随机数字表法将大鼠分为3组，即重组质粒大鼠组(转染pcDNA3.1- ELF5+EGFP的人卵巢癌细胞)、空质粒大鼠组(转染空载质粒的人卵巢癌细胞)、未经转染大鼠组(未经转染的人卵巢癌细胞)，将处于对数生长期的3组细胞2×104/mL接种于NOD/SCID小鼠左前肢腋下。对比3组小鼠的移植瘤质量和体积，计算各组小鼠肿瘤抑制率(首先对转移瘤行HE染色进行病理组织学检查以确定其致瘤性)。Western blotting法检测3组NOD/SCID小鼠移植瘤组织中MMP-2及MMP-9蛋白的相对表达量。结果 人卵巢癌细胞转染pcDNA3.1- ELF5+EGFP真核表达载体后，可稳定表达，且于72 h后转染率较高；与空质粒组和未经转染组比较，重组质粒组MMP-2及MMP-9蛋白相对表达量降低(P均<0．05)。Transell试验中，重组质粒组穿膜细胞数少于空质粒组及未经转染组(P均<0.05)。重组质粒大鼠组抑瘤率达64.4%。重组质粒大鼠组与其余两组比较，其瘤组织中MMP-2及MMP-9蛋白相对表达量降低(P<0．05)，而空质粒大鼠组和未经转染大鼠组比较，P均>0.05。结论 ELF5基因可能通过抑制MMP-2及MMP-9的表达而降低卵巢癌细胞的侵袭转移能力。

卵巢癌；ELF5基因；Ets转录因子家族;细胞转染；细胞侵袭；细胞转移；移植瘤；大鼠

卵巢癌是一种高致死率疾病，且缺乏有效的早期筛查检测方法。因此大多数患者被确诊时已为晚期，5年生存率<40%[1]。卵巢癌早期诊断困难，复发、转移率高，治疗期间易对化疗药物产生抗性，使其成为一种高病死率的疾病。深入研究并探讨卵巢癌的生物学行为及其分子机制，为卵巢癌患者寻求更好的治疗方案已成为全球关注的焦点。转录因子是转换内部和外部刺激，通过多信号传导途径进而影响基因表达变化的一类细胞因子[2]。EIF5是Ets转录因子家族中具有上皮特异性的一个成员，也被称为ESE2,它位于人11号染色体短臂13～15区，这个区域在癌症中易发生杂合性丢失[3]。该家族对细胞一系列正常生理过程，如分裂、分化、凋亡均有调节作用，同时细胞肿瘤的发生皆与之相关。2015年2月～2016年8月，本课题组探讨了ELF5基因转染后对卵巢癌细胞的体外生物学行为，包括细胞侵袭转移能力的影响，同时探讨了其对大鼠卵巢移植癌生长的抑制作用，以探索ELF5基因作为卵巢癌基因治疗靶向分子的潜能，并为卵巢癌的基因治疗提供新的候选基因与实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞株由本课题组筛选并保存。24只雌性NOD/SCID大鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，鼠龄4～6周，体质量18～25 g。实验室条件需要无特殊病原体，喂食大鼠水、饲料，以及铺垫须经过严格的微生物控制。RPMI1640培养基购自Hyclone公司，鼠抗MMP-2单克隆抗体、兔抗MMP-9单克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司，DMSO购自Biosharp公司，细胞培养板、Matrigel和Transwell小室购自Sigma公司。

1.2 细胞培养 人卵巢癌细胞采用含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、Noggi及白血病抑制因子的无血清培养基，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的恒温密闭培养箱内传代培养。期间视细胞状态以决定是否换液，3～4 d后，待细胞达到约90%融合时，传代以保持细胞良好状态。

1.3 稳定转染ELF5基因的人卵巢癌细胞的构建以及筛选 含有ELF5基因的pcDNA3.1- ELF5+EGFP真核细胞表达载体参照文献[4]建立。转染前1 d将对数生长的细胞接种于6孔板内，每孔接种5×105个细胞，设未经转染组作为对照。待细胞贴壁80%左右时用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核细胞表达载体体外转染至卵巢癌细胞(重组质粒组)，同法将pcDNA3.1-EGFP转染至卵巢癌细胞(空质粒组)，转染6 h后加入等体积含10%胎牛血清的培养液，继续培养48～72 h，G418筛选稳定转染的卵巢癌细胞用含G418(350 ng/μL)的完全培养基继续培养，1周后细胞大部分死亡，消化存活的细胞并稀释为1个/10 μL，转移至96孔板中继续加G418进行培养，单个存活细胞增殖并形成克隆，经RT-PCR进行验证后扩大培养。用于Transwell小室侵袭、迁移试验及Western blotting法检测。

1.4 细胞ELF5 mRNA 表达的检测 采用Q-PCR法。上述各组细胞转染后培养48 h，分别提取各组细胞总RNA，加入短片段引物进行Q-PCR，通过内标基因GAPDH校正，所获PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，对各组细胞样品ELF5基因的表达量进行分析。ELF5的PCR引物：F Primer：5′CCCATGCCATTGATGCTGA3′，R Primer：5′GGTGAGCTGCCACAGTTATTTGA3′。PCR反应条件：95 ℃ 30 s,然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。采用SYBR Green 1荧光染料嵌合法，通过电泳检测扩增得到的cDNA片段, 熔解曲线分析，运用2-ΔΔCT方法处理数据。

1.5 细胞内MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量的检测 采用Western blotting法。细胞转染后72 h加人裂解液提取标本蛋白,-20 ℃保存，测定蛋白浓度，制备分离胶与浓缩胶，上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜至PVDF膜，将PVDF膜浸泡于50 g/L 脱脂牛奶,置摇床1.5 h后洗脱。一抗室温孵育2 h，弃掉一抗，加入二抗，于室温平缓摇动2 h。TBST液洗脱PVDF膜，扫描PVDF膜,放入暗盒进行X线显影，用Image J图像软件分析结果，与对应β-actin的吸光度值之比作为目的蛋白的相对表达量。

1.6 各组细胞侵袭转移能力的检测 采用Transwell侵袭迁移及划痕试验。Transwell细胞侵袭试验：每个Transwell小室加入 Matrigel基质胶50 μL(于实验前由-20 ℃冰箱转置4 ℃冰箱过夜融化，经RPMI1640培养液按1∶5稀释)，使其均匀包被Transwell小室基底膜，置于37 ℃、5% CO2培养箱放置1～2 h，待基质胶完全凝固。将各组细胞用无血清培养基重悬为单细胞悬液，以1×105/孔接种于铺好基质胶的Transwell小室中。上层为200 μL细胞悬液，下层为500 μL含10%胎牛血清的培养基继续培养24 h。显微镜下计算穿膜细胞数。重复3次，计算平均值。Transwell细胞迁移试验:具体操作步骤同“Transwell侵袭”试验。Transwell迁移试验中，小室不需包被Matrigel基质胶。将小室取出，PBS冲洗，用无菌棉棒轻轻拭去上室基底膜底面的细胞，95%甲醇固定，结晶紫染色，24 h后显微镜下计算穿膜细胞数。划痕试验：3组细胞分别以同等浓度种植进入6孔板，用经灭菌100 μL枪头垂直在培养板上垂直划痕，用培养基缓缓洗两遍，以洗去被划下的细胞，加入无血清培养基。之后每隔12 h在相差显微镜下随机选择5个视野拍摄相差图片，动态监测48 h，计算迁移到划痕空隙的细胞总数，以此反映细胞转移情况，每组重复3次。

1.7 人卵巢癌NOD/SCID鼠移植瘤模型的建立及分组 将符合条件的24只裸鼠应用随机数字表法随机分为3组，即重组质粒大鼠组(转染pcDNA3.1- ELF5+EGFP的人卵巢癌细胞)、空质粒大鼠组(转染空载质粒的人卵巢癌细胞)、未经转染大鼠组(未经转染的人卵巢细胞)各8只，将处于对数生长期的3组细胞(2×104/mL),以0.5 mL/只接种于NOD/SCID小鼠左前肢腋下。大约于接种1周后，通过观察每只小鼠左前肢腋窝有瘤样肿物突起物，判断瘤荷鼠模型建立是否成功,实验过程中未死亡NOD/SCID鼠纳入结果分析。对比3组NOD/SCID小鼠移植瘤的生长情况，包括移植瘤的质量和体积，肿瘤体积计算公式:V=ab2×π/6，a为长径，b为短径，计算肿瘤抑制率[(1- 实验组瘤质量/对照组瘤质量)×100%]。

1.8 NOD/SCID鼠移植瘤体组织中MMP-2及MMP-9蛋白相对表达量的检测 在大鼠接种第5周，待部分移植瘤体积接近1 000 mm3时，处死小鼠，取出每组NOD/SCID鼠的瘤体，首先经病理组织学检验以明确其致瘤性，后采用Western blotting法检测MMP-2及MMP-9蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 pcDNA3.1- ELF5+EGFP重组质粒在卵巢癌细胞中的表达 各组细胞转染48 h后，置于倒置荧光显微镜下观察，重组质粒组和空质粒组均可见到绿色荧光蛋白表达，而未经转染组未见到绿色荧光，证明pcDNA3.1- ELF5+EGFP重组质粒和pcDNA3.1-EGFP空质粒均成功转染至卵巢癌细胞中且有表达。

2.2 各细胞组ELF5 mRNA表达比较 重组质粒组、空质粒组、未经转染组ELF5 mRNA相对表达量分别为2.97±0.69、1.00、1.00，重组质粒组高于其他两组(P均<0.05)；其他两组间比较，P>0.05。

2.3 各细胞组卵巢癌细胞侵袭转移能力比较 将各组转染细胞分别接种于上室培养24 h后，显微镜下观察显示各组均有细胞通过Matrigel基质胶的滤膜，重组质粒组、空质粒组、未经转染组穿膜细胞数分别为(82.1±3.6)、(135.6±3.7)、(142.3±4.1)个/200倍视野。重组质粒组与其他各组比较，穿膜细胞数减少(P均<0．01)，而其他两组间比较，P>0．05。将各组转染细胞接种于上室培养24 h，显微镜下观察各组均有细胞穿过滤膜，重组质粒组、空质粒组、未经转染组穿膜细胞数分别为(93.2±2.5)、(150.6±4.3)、(149.4±5.1)个/200倍视野。重组质粒组、未经转染组迁移出细胞数分别为(155.5±3.1)、(251.7±3.4)、(267.4±4.1)个/200倍视野，空质粒组和未经转染细胞组迁移细胞数均高于重组质粒组(P均<0．01)，其两组间比较，P>0．05。

2.4 各大鼠组裸鼠移植瘤及主要器官的病理形态学特征 首先各组大鼠移植瘤皆证实为卵巢癌，同时重组质粒大鼠组在镜下表现为肿瘤细胞大片坏死，部分细胞瓦解、碎裂，而空质粒大鼠组和未经转染大鼠组肿瘤细胞坏死不明显，多数表现为肿瘤细胞大小不一，形态各异，排列紊乱。

2.5 各大鼠组移植瘤质量及体积比较 重组质粒组移植瘤小且种植部位计数明显低于空质粒组和未经转染组；重组质粒大鼠组抑瘤率达64.4%。重组质粒大鼠组、空质粒大鼠组、未经转染大鼠组移植瘤质量分别为(0．28±0．16)、(0．86±0．17)、(0．91±0．19)g，重组质粒大鼠组低于空质粒大鼠组及未经转染大鼠组(P均<0．01)；空质粒大鼠组及未经转染大鼠组比较，P>0．05。重组质粒大鼠组接种2、3、4、5周移植瘤体积分别为(165.63±16.13)、(235.93±20.59)、(281.12±19.36)、(323.41±26.12)mm3，空质粒大鼠组分别为(171.42±16.72)、(398.25±27.76)、(568.54±47.12)、(892.57±73.35)mm3，未经转染大鼠组分别为(189.72±17.32)、(423.34±31.12)、(618.85±49.03)、(921.67±85.34)mm3，重组质粒大鼠组与其他两组不同时间比较，P均<0．05；空质粒大鼠组及未经转染大鼠组不同时间比较，P均>0．05。

2.6 各细胞组细胞中及各大鼠组移植瘤组织中的MMP-2及MMP-9蛋白相对表达量比较 重组质粒组、空质粒组及未经转染组中MMP-2蛋白相对表达量分别为0.45±0.02、1.47±0.07、1.23±0.03,MMP-9蛋白相对表达量分别为0.32±0.01、1.67±0.02、1.59±0.09,重组质粒组MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量低于空质粒组及未经转染组(P均<0.05)，而空质粒组及未经转染组比较，P>0．05。重组质粒大鼠组、空质粒大鼠组及未经转染大鼠组移植瘤组织中MMP-2蛋白相对表达量分别为0.42±0.03、0.98±0.03、1.00±0.09,MMP-9蛋白相对表达量分别为0.27±0.02、0.95±0.02、1.00±0.08,重组质粒大鼠组移植瘤组织中MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量低于空质粒大鼠组及未经转染大鼠组(P均<0.05)，而空质粒大鼠组及未经转染大鼠组比较，P均>0．05。

3 讨论

最近，有专家提出肿瘤干细胞是癌症复发的原因[5]。传统的化疗甚至能杀死大多数肿瘤细胞，但对肿瘤干细胞却无法起到靶向治疗作用，原因就在于肿瘤干细胞区别于成熟、已分化的细胞，其一是能对化疗药物产生抗性。因为肿瘤干细胞和其他正常干细胞一样，且有着更能抵抗DNA损伤诱导的细胞死亡的生存优势，以维护基因组完整性[6]。这表明，初步治疗增加了肿瘤干细胞耐药的比例，因其能产生获得性化疗耐药，因而不可避免地出现复发。因此，定义卵巢癌干细胞和识别其调控分子，联合治疗靶向清除肿瘤干细胞是有效治疗卵巢癌的关键。本课题组在前期研究中以人卵巢癌细胞株HO8910细胞为研究对象，筛选出具有“癌干细胞”特性的CD133+CD117+细胞，并对其相关的干细胞“特性”进行了系统的鉴定，结果表明，本课题组所提取出的“癌干细胞”体内成瘤能力显著，自我更新和分化能力明显，并具有多药耐药等肿瘤干细胞的特征[7]。而就目前分离鉴定卵巢癌干细胞所依据的标志物以及方法仍存在较多的争议,因此我们对分离出的“癌干细胞”尚均称为卵巢癌细胞。

近十年来，肿瘤干细胞或者肿瘤起始细胞的起源尚不明确，但一些具有肿瘤异质性的细胞群落已经在许多恶性肿瘤中被证实存在，并猜测其可能为肿瘤组织细胞克隆的核心，具无限增殖、自我更新和多向分化、高致瘤性和抵抗放化疗的能力，而这些都是肿瘤干细胞的一些特性[8]。脱离原发灶侵袭邻近组织和远处广泛转移是造成卵巢癌患者高病死率的首要原因，因此，如何限制卵巢癌的侵略性行为是当前有效提高卵巢癌治疗效果的重要攻克目标。

Ets家族成员对于细胞的增殖、分化、发育及凋亡等正常的生理活动都具有非常重要的调节作用，而ELF5 属于Ets家族成员[2]。目前对ELF5的研究主要集中在乳腺细胞、乳腺癌及移行细胞癌等方面。ELF5不仅对腺泡细胞的增殖、发育起影响，与其胚胎发育进程亦有一定联系[8]。在乳腺癌的研究中证实，ELF5是一个潜在的肿瘤抑制因子,可对癌细胞起抑制作用，并能抑制乳腺癌的转移[9]。本试验中，人卵巢癌细胞在转染ELF5基因后，其表现出的生物学特性，侵袭、转移以及体内成瘤能力，相对于其他两组都明显下降，因此推论，在卵巢癌中ELF5基因在其侵袭、转移中同样能起到抑制作用，同时体外侵袭、转移能力是体现肿瘤转移潜能的重要指标。

肿瘤细胞从原发灶脱落、突破组织屏障是导致肿瘤细胞发生转移的关键步骤。原发肿瘤形成后，脱落、黏附、降解、移动和转移形成贯穿于恶性肿瘤侵袭、转移的全过程[10]。细胞外基质(ECM )和基膜是肿瘤浸润、扩散过程中的一道天然屏障。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组降解ECM的锌离子依赖内肽酶,在肿瘤的生长、侵袭和转移中发挥至关重要作用。目前, 已确定的MMPs 有26 种,MMP-9是MMPs中明胶酶的一种,能够降解ECM 中的Ⅳ型胶原[11],从而参与肿瘤的侵袭和转移，Ⅳ型胶原是ECM和基膜的重要组成成分。肿瘤细胞分泌的MMPs中,MMP-2、MMP-9 可降解Ⅳ型胶原,在肿瘤的血管化、肿瘤细胞侵袭与转移灶形成过程中起重要作用，从而参与多种肿瘤的发生、发展和侵袭转移[12～15]。研究表明，较正常组织和良性病变，MMP-2和MMP-9在最常见的妇科恶性肿瘤的表达显著增加(如：宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌)。本研究中，我们在对卵巢癌细胞进行靶向ELF5 基因转染后使其表达，结果显示，ELF5基因上调后，卵巢癌细胞侵袭转移能力降低，MMP-2 和MMP-9蛋白表达明显下降，在动物试验中也表现出同样趋势的结果;另外，重组质粒大鼠组相对于空质粒大鼠组及未经转染大鼠组移植瘤的生长受到明显抑制，且从病理切片表现看，重组质粒大鼠组移植瘤体中肿瘤细胞出现坏死数量多，细胞核溶解、固缩明显。推测ELF5基因有抑制卵巢癌细胞生长、侵袭及转移的作用，此作用可能是通过抑制MMP-2 和MMP-9的表达而实现的。虽然具体调控机制及三者如何相互作用来影响侵袭转移的分子机制还有待进一步探讨，但可以期待ELF5有潜力作为卵巢癌基因治疗的靶向分子，并为卵巢癌的基因治疗提供新的候选基因与实验依据。

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闫洪超(E-mail:1015058194@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.013

R737.31

A

1002-266X(2017)13-0045-04

2016-10-29)