rBMSCs/F92A-Cav1对PAH大鼠的治疗作用及其机制

徐聪，夏鹏，杨红莉，唐文强，潘丽，王兰花，陈双峰，张颖新，王乐信,2，陈海英(聊城市人民医院，山东聊城252000；2 查尔斯特大学生物医学院)

rBMSCs/F92A-Cav1对PAH大鼠的治疗作用及其机制

徐聪1，夏鹏1，杨红莉1，唐文强1，潘丽1，王兰花1，陈双峰1，张颖新1，王乐信1,2，陈海英1
(1聊城市人民医院，山东聊城252000；2 查尔斯特大学生物医学院)

目的 探讨过表达F92A-丙氨酸替代窖蛋白-1(Cav1)的大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs/ F92A-Cav1)对肺动脉高压(PAH)大鼠的治疗作用及其机制。方法 予成年雄性Wistar大鼠腹腔注射1%野百合碱(MCT，60 mg/kg)建立PAH模型，建模后2周随机分为3组(10只/组)：PAH 组 (仅给予MCT)、Cav1 组 (转导LV-Cav1的rBMSCs)、F92A-Cav1 组(转导LV-F92A-Cav1的rBMSCs)，同时设置正常组。基因修饰的rBMSCs(1×106/mL)于尾静脉移植入各组PAH大鼠，移植后3周，采用Image-Pro Plus 6 software评估肺动脉中膜厚度指数(MT%)、右心肥大指数(RVHI)，采用Griess法检测血清NO水平，采用Western blotting法检测肺组织PI3K、AKT蛋白的相对表达量。结果 PAH组MT%、RVHI及肺组织PI3K、AKT蛋白相对表达量均较正常组升高，但血清NO水平降低(P<0.05或<0.01)；与PAH组相比，Cav1组、F92A-Cav1组中MT%、RVHI及肺组织PI3K、AKT蛋白相对表达量均降低，而血清NO水平增加，以F92A-Cav1组为著(P<0.05或<0.01)。结论 rBMSCs/F92A-Cav1可通过解除野生型Cav1对eNOS的抑制，促进NO释放，从而抑制PAH大鼠肺组织PI3K/AKT通路激活，进而发挥对PAH大鼠的治疗作用。

肺动脉高压；窖蛋白-1；骨髓间充质干细胞；大鼠

肺动脉高压(PAH)是一种多因素参与的进展性疾病, 肺动脉平滑肌细胞在PAH的发展中起至关重要作用[1]。一氧化氮合酶(eNOS)催化生成的NO具有舒血管、抗炎、抗凝、抗细胞增殖及转移作用，对心血管系统具有保护作用[2]。既往Bernatchez等报道及本课题组前期研究均显示，采用丙氨酸替代窖蛋白-1(Cav1)的92位苯丙氨酸获得的突变型Cav1(F92A-Cav1)不具有抑制eNOS的活性，体外可促进NO产生[3]、血管生成，并降低肺动脉压力[4, 5]。Cav1与蛋白激酶B(AKT)的表达相关[6]，而激活的磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT可活化eNOS，Cav1结构域中的92位苯丙氨酸可调控AKT信号[7]。此外，间充质干细胞(MSCs) 以其自我更新和多向分化潜能的特性凸显其在受损组织再生治疗方面的优势。2015年5月～2016年10月，本课题组采用F92A-Cav1基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)获得rBMSCs/F92A-Cav1，移植入PAH大鼠，探讨其治疗作用及机制，为相关血管性疾病的研究及治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：3周龄雄性Wistar大鼠(100～120 g，证号SCXK山东20090001)购自山东大学实验动物中心。严格饲养在无特异性病原菌(SPF)级、恒温( 20～26 ℃)、恒湿(45%～50%)、空气洁净的层流架内；垫料、笼具、饲料及饮水均高压灭菌。所有与动物相关的研究按照美国国家卫生研究院所描述的指南“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”执行，并且实验方案通过聊城市人民医院伦理委员会批准。质粒与细胞株：突变的Cav1克隆质粒12AAPFVP-F92A-pMA-T、慢病毒包装质粒(psPax2、pRSV Rev、VSV-G)由澳大利亚查尔斯大学Dr. Padraig Strappe教授馈赠；慢病毒载体骨架pLVX-mCMV-zsgreen购自深圳市百恩维生物科技有限公司；慢病毒质粒使用前期成功构建的LV-F92A-Cav1及LV- Cav1[8]，大鼠BMSCs由实验室分离、培养，人胚肾293T细胞购自ATCC公司。主要试剂：Lipofectamin2000购自Life Technologies；Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit 购自Biovision公司；Phospho-PI3K兔多克隆抗体及Phospho-AKT兔单克隆抗体购自cell signaling公司。仪器：PCR检测仪ADI7500购自美国ABI公司；Western blotting 显影仪购自美国Protein Simple公司；SpectraMax M5酶标仪购自美国Molecular Devices 公司；NO比色分析试剂盒购自美国Biovision公司。

1.2 rBMSCs的分离、培养及鉴定 按照实验室分离rBMSCs的方法[5]，Ficoll-Paque密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞，接种于含DMEM/F-12完全培养基的T25细胞培养瓶，置37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，3 d后去除未贴壁细胞，以后每隔3 d更换新的培养基。流式细胞仪鉴定细胞表型，细胞成骨及成脂多向分化鉴定方法同文献[4]。

1.3 PAH大鼠模型建立及实验分组 1% 野百合碱(MCT)60 mg/kg腹腔注射Wister大鼠建立PAH模型，建模后2周，将PAH大鼠随机分为3组：PAH 组 (仅给予MCT)、Cav1 组(转导LV-Cav1的rBMSCs)、F92A-Cav1 组 (转导LV-F92A-Cav1的rBMSCs)；同时设置正常组。每组10只大鼠，各组实验大鼠分别做好标志分笼饲养，自由摄食摄水，昼夜时间1∶1。病毒包装及转导rBMSCs方法同文献[4]，按照本实验室既往移植方法[5]，基因修饰的rBMSCs (1×106/mL)于尾静脉移植入各组PAH大鼠，正常组大鼠尾静脉注射生理盐水。rBMSCs移植后3周，取各组的血标本及肺组织保存以备后续研究。

1.4 右心室(RV)质量变化的观察 移植后3周，各组大鼠以水合氯醛(400 mg/kg)腹腔内注射麻醉，将2Fr微导管缓慢推送至右心室(RV)，按文献[5]实验方法采用BIOPAC Systems进行压力测定并记录压力曲线。压力测量完成后，注射10倍全麻剂量的水合氯醛处死动物，取心脏，剪除心房，沿室间沟边缘分别游离RV及左心室和室间隔(LV+S)。滤纸吸水后分别称重，以右室肥大指数(RVHI)[RV/(LV+S)]反映RV质量变化。

1.5 肺小动脉血管结构及中膜厚度的观察 取左下部分肺组织置入10%甲醛液固定24 h，常规脱水、石蜡包埋、制片及HE染色，观察肺小动脉病变及结构。采用Image-Pro Plus 6分析测量与终末细支气管伴行的肺小动脉管壁中膜厚度(MT)及外径(ED)，分析并计算MT占ED的百分比即肺动脉厚度指数(MT%)。

1.6 大鼠血清NO水平测定 采用Griess法。采用NO比色分析试剂盒测定NO的稳定终末产物亚硝酸盐含量，StakmaxTM酶标仪测定540 nm处吸光度，亚硝酸盐含量通过系列稀释的亚硝酸盐标准溶液制备的标准曲线按试剂盒说明书公式计算获得。每样品3个复孔，实验重复3次。

1.7 肺组织中PI3K和AKT蛋白表达的检测 采用Western blotting法。各组大鼠肺组织匀浆，加预冷的蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂PMSF，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清；每孔上样15 μg蛋白质，10% SDS-PAGE电泳，转膜；封闭液室温封闭1 h；分别加入anti-Phospho-PI3K(Tyr458/Tyr199, 1∶1 000)兔多克隆抗体和anti-Phospho-AKT(Thr308, 1∶1 000)的兔单多克隆抗体4 ℃过夜；加入相应二抗室温孵育1 h；ECL试剂显色，AlphaView(ProteinSimple, USA)图像分析系统分析蛋白条带，并将β-actin作为内参。

2 结果

2.1 rBMSCs的表型及功能鉴定结果 分离培养的rBMSCs具有间质细胞的特性，其上皮细胞特异性标志CD31(6.7%)及造血细胞特异性标志CD34(6.1%) 与CD45(8.9%)呈低表达，而间充质干细胞的特异表型CD44(92.2%)与CD90(91.5%)表达显著增高，并可向成骨及成脂分化。说明成功获得具有多向分化潜能的rBMSCs。

2.2 各组RVMI、MT%比较 正常组、PAH组、Cav1组、F92A-Cav1组RVMI分别为0.201±0.082、0.784±0.208、0.506±0.151、0.355±0.097，MT%分别为13.835%±2.016%、29.157%±3.960%、22.887%±3.130%、20.863%±4.367%；与正常组比较,其余组RVMI、MT%均升高(P<0.05或<0.01)；与PAH组比较，Cav1组、F92A-Cav1组RVMI、MT%降低。尤以F92A-Cav1组为著(P<0.05或0.01)。

2.3 各组血清NO水平及肺组织PI3K、AKT蛋白表达比较 正常组、PAH组、Cav1、F92A-Cav1组血清NO分别为(10.249±0.401)、(5.530±0.413)、(10.756±1.178)、(19.131±1.540)μmol/L，肺组织PI3K蛋白相对表达量分别为0.298±0.045、0.769±0.083、0.650±0.093、0.578±0.041，肺组织AKT蛋白相对表达量分别为0.378±0.060、1.090±0.087、0.919±0.052、0.433±0.051。与对照组相比，PAH组血清NO水平降低，肺组织PI3K、AKT蛋白相对表达量升高(P<0.05或<0.01)。与PAH组比较，Cav1、F92A-Cav1组血清NO水平升高，肺组织PI3K、AKT蛋白相对表达量降低，均以F92A-Cav1组为著(P<0.05或<0.01)。

3 讨论

PAH是以渐进性的肺血管阻力增加和肺血管收缩为特征，肺动脉血管内皮细胞最先受到攻击并发生病理变化[9]，内皮功能障碍导致eNOS生成扩血管物质NO减少[10]，然而，血管内皮生成的NO具有良好的抗炎、抗血小板和血管舒张作用[11]。此外，MSCs以其自我更新和多向分化潜能的特性在受损组织再生治疗方面具有显著优势，因此，本课题采用F92A-Cav1基因修饰移植的rBMSCs治疗PAH大鼠。本研究结果证实，rBMSCs/F92A-Cav1可促进NO释放，缓解肺血管平滑肌增殖所致的动脉管腔狭窄及RV肥大，抑制PI3K/Akt激活，有效治疗PAH。

MCT可选择性损伤肺血管内皮，引起慢性血管炎症性病变，其诱导的PAH更接近于临床发病机制。MCT诱导的PAH 不仅可激活细胞间质标志——平滑肌肌动蛋白，还可激活AKT通路[1]，促进血管平滑肌细胞增殖。PAH的标志性病理特征是肺外周小动脉内膜增厚、纤维化，中膜增厚及外膜变化[12]。本研究中，F92A-Cav1组大鼠肺动脉血管壁的厚度及管腔狭窄程度均显著低于PAH组。前期研究[5]也证实，其可有效降低肺动脉压力，说明采用突变的Cav1修饰rBMSCs可有效改善PAH大鼠肺小动脉内膜增生及中膜平滑肌增殖。

Cav1作为细胞膜上小窝的主要结构成分，是多种信号通路整合的支架蛋白，对许多信号具有调节作用，因此，F92A-Cav1可能也会对PAH中的信号通路具有调节作用。本研究发现，rBMSCs/F92A-Cav1可抑制PAH大鼠肺组织中PI3K/AKT的激活。针对Cav1对PI3K/AKT通路的作用以及PI3K/AKT的激活在PAH中的作用，相关研究报道也不尽相同。但生物过程中各种信号的相互作用和优劣对比，决定了最终的作用结果。Cav1参与了丝裂原活化的蛋白激酶信号通路、肿瘤、血管生成、神经性疾病和衰老等过程，在不同的细胞类型和环境中表现出不同功能[13]。一部分研究显示，过表达Cav1可激活ATP依赖的酪氨酸激酶AKT通路[14]，PI3K/AKT通路的激活促进肺血管平滑肌细胞增殖，抑制该通路则抑制血管平滑肌细胞增殖[15]，缓解缺氧诱导的PAH[16]。另有研究显示，过表达Cav1可提高Fas表达水平和Caspase-3/7活性，促进特发性肺纤维化(IPF)成纤维细胞的凋亡，而AKT可使转录因子叉头框O3a失活下调Cav1和Fas的表达，赋予IPF成纤维细胞的凋亡抗性表型,并促进IPF进展[17]；还有研究显示，激活PI3K/AKT/eNOS信号通路可减轻MCT诱导的PAH[18]，PI3K/AKT的激活通过促进eNOS的磷酸化引起NO依赖的血管舒张，而Cav1也可通过PI3K/AKT负性调控eNOS的活化[19]。Trane等[7]研究认为，Cav1结构域中的92位的苯丙氨酸可调控AKT 信号，突变型Cav1可降低野生型Cav1介导的AKT活性，而不会降低NO的产生。本课题研究与其研究结果一致，由于Cav1可激活PI3K/AKT通路引起eNOS活性降低，通过突变Cav1获得的F92A-Cav1不仅抑制PI3K/AKT通路，且可解除Cav1对eNOS的抑制，从而促进NO释放。

综上所述，rBMSCs/F92A-Cav1抑制PAH大鼠肺组织PI3K/AKT通路激活，同时可解除野生型Cav1对eNOS的抑制，促进NO释放，有效发挥NO的抗炎、扩血管等多种生物学功能，改善PAH大鼠肺血管病变。该研究为类似血管性疾病治疗奠定了科学的理论基础。

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Therapeutic effect and mechanism of rBMSCs/F92A-Cav1 on PAH rats

XUCong1,XIAPeng,YANGHongli,TANGWenqiang,PANLi,WANGLanhua,CHENShuangfeng,ZHANGYingxin,WANGLexin,CHENHaiying

(1LiaochengPeople'sHospitalLiaocheng252000,China)

Objective To investigate the therapeutic effect and mechanism of Caveolin-1 (Cav1) mutant to F92A-Cav1 modified rat bone marrow mesenchymal stem cells (rBMSCs/F92A-Cav1) on rats with pulmonary hypertension (PAH). Methods PAH was induced by intraperitoneal injection of 1% monocrotaline (MCT, 60 mg/kg) in adult male Wistar rats. The PAH rats were randomly divided into four groups (10 rats/group) after 2 weeks of MCT injection: PAH group (only MCT), Cav1 group (transduced with LV-Cav1 modified rBMSCs), F92A-Cav1 group (transduced with LV-F92A-Cav1modified rBMSCs), and the control group. Gene modified rBMSCs (1×106/ml) were transplanted into PAH rats in each group by tail vein injection. After 3 weeks of transplantation, the percentage of media wall thickness (MT%) and right ventricular hypertrophy index (RVHI) were evaluated by Image-Pro Plus 6 software, serum NO concentration was checked by Griess method, and the expression of phosphoinositide 3-kinase(PI3K) and protein kinase B (AKT) was detected by Western blotting. Results MT%, RVHI, PI3K and AKT was all increased but NO was decreased in the PAH group as compared with that of the control group(P<0.05 orP<0.01). Compared with the PAH group, MT%, RVHI, PI3K and AKT was decreased but NO was increased in the Cav1 and F92A-Cav1 groups, especially in the F92A-Cav1 group (P<0.01).Conclusion F92A-Cav1 can abrogate the inhibitory effect of wild-type Cav1 on eNOS and promote the release of NO, then inhibit the activation of PI3K/Akt signaling pathway and thus exert its therapeutic effect on PAH rats.

pulmonary arterial hypertension; Caveolin-1; mesenchymal stem cells; rats

国家自然科学基金资助项目(81270104)；山东省自然科学基金资助项目(ZR2016HP33)。

徐聪(1990-)，女，技师，主要研究方向为干细胞对血管性疾病的治疗。E-mail:xucong817@126.com

陈海英(1969-)，女，副主任技师，主要研究方向为干细胞对血管性疾病的治疗。E-mail:hychenmay5@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.006

R563.9

A

1002-266X(2017)13-0020-04

2016-10-27)