血浆EGFR基因突变检测在晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKI疗效评估中的价值

冯卫能,张华,陈泽程,唐溢聪,梁剑苗,邓燕明(广东省佛山市第一人民医院，广东佛山528000)

血浆EGFR基因突变检测在晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKI疗效评估中的价值

冯卫能,张华,陈泽程,唐溢聪,梁剑苗,邓燕明
(广东省佛山市第一人民医院，广东佛山528000)

目的 探讨血浆表皮生长因子受体(EGFR)突变状态检测在晚期非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)疗效评估中的价值。方法 应用扩增阻滞突变系统(ARMS)法检测70例晚期非小细胞肺癌患者肿瘤组织及血浆的EGFR突变状态。以肿瘤组织中的EGFR突变状态检测为对照，计算血浆中EGFR突变状态检测的敏感性、特异性、一致性，并比较两种检测对患者EGFR-TKI疗效及预后评估的差异。结果 以配对的肿瘤组织EGFR突变检测结果为对照，ARMS法检测血浆EGFR突变的敏感性、一致性及特异性分别为58.1%、72.9%、96.3%。在38例经过EGFR-TKI治疗的患者中，肿瘤组织EGFR突变型患者的有效率及中位无进展生存期均优于EGFR野生型患者(有效率：69% 比11.1%，P=0.005；无进展生存期：10个月比3个月，P=0.003)。血浆EGFR突变型患者与肿瘤组织EGFR突变型患者的有效率及中位无进展生存期均相似(有效率：P=0.908；中位无进展生存期：P=0.593)。在血浆标本中，EGFR突变型患者的中位无进展生存期长于EGFR野生型患者(10个月比7个月 ，P=0.032)。EGFR突变型患者的有效率高于EGFR野生型患者，但差异无统计学意义(70.6%比42.9%，P=0.111)。 结论 血浆EGFR突变可预测晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKI疗效，但因较高的假阴性率，血浆EGFR野生型患者需应用肿瘤组织进一步检测。

非小细胞肺癌；扩增阻滞突变系统；表皮生长因子受体；循环肿瘤DNA

肺癌是世界范围最常见的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%，超过65%的NSCLC在诊断时已属晚期[1]。表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)是目前治疗晚期NSCLC主要方法。研究显示，EGFR基因突变状态是EGFR-TKI疗效的重要预测因子， EGFR突变检测是合理应用EGFR-TKI的先决条件[2]。检测EGFR突变首选应用肿瘤组织，但晚期NSCLC肿瘤组织获取往往比较困难而限制进行EGFR突变检测。近年应用患者血液循环肿瘤DNA(ctDNA)进行肿瘤基因分型的“液体活检”方法受到关注，“液体活检”为非侵入性检查，可以避免组织标本量少的问题，有利于提高临床实践中EGFR基因突变的检测率[3]。ARMS法是一种高度敏感的检测肿瘤组织EGFR突变方法，本研究通过检测晚期NSCLC患者配对的肿瘤组织和血浆标本的EGFR突变状态，探讨ARMS法检测血浆EGFR突变在患者EGFR-TKI疗效评估中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择本院2011年6月～2013年6月收治的晚期NSCLC患者70例， 均经组织学确诊。按2009年国际抗癌联盟(UICC)肺癌TNM分期均为Ⅳ期。患者男29例，女41例；年龄38～78岁、中位年龄62岁；腺癌63例，鳞癌7例；行为状态评分(PS)0～1分 54例，PS 2分16例；吸烟20例，不吸烟50例。其中一线接受EGFR-TKI治疗13例，二线或二线以上接受EGFR-TKI治疗25例。

1.2 治疗方法 EGFR-TKI治疗方法：吉非替尼 250 mg ，1次/d或厄洛替尼 150 mg ，1次/d，持续服用直至病情进展或毒性不可耐受。疗效评估：近期疗效按照实体肿瘤的疗效评价标准1.1版[4]分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)，获得CR或PR的患者4周后再确认疗效。有效率=(CR+PR)病例数/总病例数。远期疗效为无进展生存期(PFS)。PFS定义为从EGFR-TKI治疗开始至疾病进展或任何原因导致死亡的时间。EGFR-TKI治疗结束后每8周随访一次，末次随访时间为2016年6月30日。

1.3 血浆及组织EGFR基因突变检测 收集患者治疗前外周静脉血4 mL，室温放置2 h后于4 ℃低温高速离心机离心10 min(3 000 r/min)，取上层液血浆1 mL置入2 mL冻存试管放置-80 ℃冰箱保存。组织标本来自本院病理科石蜡包埋组织标本。DNA提取:依据操作说明，应用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen，德国)从5～20 mg肿瘤组织或1 mL血浆中提取DNA。应用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，美国)测定DNA浓度 。采用人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)(厦门艾德生物医药科技有限公司，中国),按照试剂盒说明书进行操作，检测患者组织及血浆第18～21外显子最常见的29种体细胞突变。按照试剂盒说明书结果判定方法，EGFR突变阳性判断标准为：①循环阈值(Ct)<26；②26≤Ct<29，同时符合ΔCt值(突变Ct-外控Ct)≤11(19-del 突变、L858R 突变)或ΔCt值≤7(G719X 突变)或ΔCt值≤8(S768I 突变、L861Q突变)。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。配对肿瘤组织与血浆中EGFR突变状态的一致性采用Kappa检验。EGFR基因突变状态与EGFR-TKI有效率的关系采用χ2检验及Fisher′s精确检验。EGFR突变状态与PFS的关系采用Kaplan-Meier法分析，Log-rank检验差异性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 晚期NSCLC患者血浆与肿瘤组织中EGFR基因突变状态比较 在70例患者配对的肿瘤组织及血浆中，肿瘤组织EGFR基因突变发生率为61.4%(43/70)，其中19del突变占46.5%(20/43)、L858R突变占44.2%(19/43)、L861Q突变占4.7%(2/43)、G719X突变占2.3%(1/43)、S768I突变占2.3%(1/43)。血浆EGFR基因突变发生率为37.1%(26/70)，其中19del突变占46.2%(12/26)、L858R突变占42.3%(11/26)、L861Q突变占7.7%(2/26)、S768I突变占3.8%(1/26)。肿瘤组织与血浆检测EGFR基因突变的一致性为72.9%(51/70)(κ=0.487，P<0.01)。与肿瘤组织检测EGFR突变相比，血浆检测EGFR突变的敏感性为58.1%(25/43)、特异性为96.3%(26/27)。

2.2 血浆与肿瘤组织EGFR突变型与野生型晚期NSCLC患者EGFR-TKI有效率比较 肿瘤组织EGFR突变型与野生型患者EGFR-TKI治疗的有效率分别为69%(20/29)、11.1%(1/9)，两者比较，P=0.005。血浆EGFR突变型与野生型患者EGFR-TKI有效率分别为70.6%(12/17)、42.9%(9/21)，两者比较，P=0.111。血浆与肿瘤组织EGFR突变型患者的有效率比较，P=0.908。

2.3 血浆与肿瘤组织EGFR突变型与野生型晚期NSCLC患者PFS比较 肿瘤组织中EGFR突变型及野生型患者的中位PFS分别为10、3个月，两者比较，P=0.003。血浆EGFR突变型、野生型患者的PFS分别为12、7个月，两者比较，P=0.032。肿瘤组织EGFR突变型患者与血浆EGFR突变型患者的中位PFS比较，P=0.593。

3 讨论

EGFR突变检测是合理应用EGFR-TKI治疗晚期NSCLC的先决条件，肿瘤组织是EGFR突变检测优先选择的生物材料[2]。但晚期NSCLC组织标本主要为肺穿刺或支气管镜活检的小标本，31%晚期NSCLC患者因为标本量不足而不能实施基因检测[5]。而且，肿瘤异质性会导致活检的小标本不能准确反映肿瘤整体的基因改变[6]。由于应用肿瘤组织进行基因检测存在不足，以血液为生物材料进行基因检测的“液体活检”成为一种重要的新方法，ctDNA是“液体活检”最重要的检测材料之一。

目前，国内检测晚期NSCLC肿瘤组织EGFR基因突变最常用的方法是直接测序法和ARMS法。相比直接测序法，ARMS法具有更高的灵敏性及阴性预测价值[7]。对于ARMS法检测肿瘤组织EGFR突变型的患者，EGFR-TKI的有效率为60%～80%，中位PFS为8～10个月，明显优于EGFR野生型患者[7]。本研究结果与上述报告相似。

近年来，ARMS法也被应用于检测晚期非小细胞肺癌ctDNA的EGFR突变。Goto等[8]用ARMS法检测86例晚期NSCLC血浆标本EGFR突变，与配对的肿瘤组织标本相比，其敏感性、一致性分别为43.1%，100%、 66.3%。另有研究发现,ARMS法检测晚期NSCLC血浆EGFR突变的敏感性、特异性、一致性分别为48.2%、95.4%、73.6%。本研究结果与文献报道相似，敏感性、特异性、一致性分别为58.1%、96.3%、72.9%。提示ARMS法检测ctDNA的EGFR突变具有高特异性，但灵敏性仍不理想，假阴性率较高(40%～50%)，如果检测结果为EGFR野生型，需注意排除假阴性可能。此外，本研究中有1例患者肿瘤组织检测为EGFR野生型，而ctDNA检测为EGFR突变型，可能与肿瘤异质性有关[6]。

至今，关于ARMS法检测血浆EGFR突变状态与EGFR-TKI疗效关系的研究仍然较少。Li等分析结果显示，对于ARMS法检测血浆EGFR突变型的晚期NSCLC患者，EGFR-TKI的有效率及PFS分别为68.4%、7.9个月。而血浆EGFR野生型患者的有效率及PFS分别为38.9%、6.1个月。有研究报告血浆EGFR突变型晚期NSCLC患者的PFS为10.88个月，而血浆EGFR野生型患者的PFS为9.89个月。在本研究中，血浆EGFR突变型患者的有效率及PFS与肿瘤组织EGFR突变型患者相近，PFS明显长于野生型患者。但由于存在假阴性，对于血浆EGFR野生型患者，EGFR-TKI的有效率仍然高达42.9%，PFS长达7个月，明显优于基于肿瘤组织检测EGFR野生型患者的疗效[7]。本研究结果与既往报告相似，显示ARMS法检测血浆EGFR突变阳性可预测EGFR-TKI治疗晚期NSCLC患者的有效率及PFS,但在血浆EGFR野生型患者中不能预测EGFR-TKI疗效。

本研究存在一些不足之处，为回顾性研究，样本量小，未能对不同的EGFR突变类型(19del突变、L858R突变、L861Q突变、G719X突变、S768I突变等)分别进行分析。研究结果显示不同EGFR突变类型对EGFR-TKI的疗效存在差异，不分EGFR突变类型分析可能影响研究结果的准确性。

总之，本研究显示ARMS法检测血浆EGFR突变状态可预测EGFR-TKI疗效。但ARMS法检测血浆EGFR突变具有较高的假阴性率，如检测结果为EGFR野生型，需应用肿瘤组织检测进一步确认。

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Predictive value of EGFR mutation detection in plasma for the EGFR-TKI efficacy in advanced non-small-cell lung cancer patients

FENGWeineng,ZHANGHua,CHENZecheng,TANGYicong,LIANGJianmiao,DENGYanming

(TheFirstPeople'sHospitalofFoshan,Foshan528000,China)

Objective To investigate the predictive value of epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation detection in plasma for the EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) efficacy in advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients. Methods EGFR mutations in the tumor tissues and matched plasma samples from 70 advanced NSCLC patients were assessed using amplification refractory mutation system (ARMS). The sensitivity, specificity and consistency of EGFR mutations in plasma were calculated by taking the EGFR mutations in tumor tissues as the control group. The differences of EGFR-TKI efficacy and prognosis were compared between the two detections.Results Compared with the EGFR mutation detection in the matched tumor tissues, the sensitivity, consistency and specificity of EGFR mutations in plasma detected by ARMS was 58.1%, 72.9% and 96.3%, respectively. For the 38 patients treated with EGFR-TKI, the response rate (ORR) and median progression-free survival (PFS) was significantly superior in the EGFR mutant group as compared with the wild-type group in tumor tissue samples (ORR: 69% vs. 11.1%,P=0.005; PFS: 10 months vs. 3 months,P=0.003). ORR and PFS of patients with EGFR mutation in plasma was consistent to that of patients with EGFR mutation in tumor tissues (ORR:P=0.908; PFS:P=0.593). In the plasma samples, PFS of patients with EGFR mutations was longer than that without EGFR mutations (10 months vs 7 months,P=0.032). Patients with EGFR mutations had significantly higher ORR than those without mutations (70.6% vs 42.9%,P=0.111). Conclusions The detection of EGFR mutations in plasma can predict the efficacy of EGFR-TKI. However, due to the high false negative rate in plasma samples, for the patients with wild-type EGFR in plasma, they need further confirmation in tumor tissues.

non-small-cell lung cancer; amplification refractory mutation system;epidermal growth factor receptor; circulating tumor DNA

广东省科技计划项目(20120318077)；佛山市科技创新专项基金(2014AG10003)；佛山市医学类科技攻关项目(2014AB00307)。

冯卫能(1972-)，男，副主任医师，主要研究方向为肺癌多学科综合治疗和肺癌转化性研究。E-mail:fengweineng@163.com

邓燕明(1962-)，女，主任医师，主要研究方向为肺癌多学科综合治疗和肺癌转化性研究。E-mail:yanmingdeng78@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.005

R734.2

A

1002-266X(2017)13-0017-03

2017-01-18)