急性肾损伤生物标志物研究进展

俞夏莲，王伟铭(上海交通大学医学院肾脏病研究所，上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏科，上海 200025)

急性肾损伤生物标志物研究进展

俞夏莲，王伟铭
(上海交通大学医学院肾脏病研究所，上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏科，上海 200025)

急性肾损伤(AKI)是住院患者，尤其是重症患者常见的高致死率病症。近来，专家们越来越重视通过应用生物标志物辅助诊断以及监测AKI的手段以改善AKI的预后。本文就针对肾功能改变以及肾脏损伤的一些标志物进行简要的介绍。

生物标志物；急性肾损伤

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是临床常见的危重病症。AKI的发病率逐年上升，主要与高龄患者数量的上升、多合并症患者增多以及诊断标准的改变有关。目前改善肾脏病全球预后(KDIGO)指南以及RIFLE标准均以血清肌酐和尿量指标作为AKI诊断和分期的标准[1]。但是血清肌酐的异常和少尿的出现往往在肾小管或肾细胞发生急性损伤进展到临界阈值之后才出现。国内的一项大型横断面研究显示根据KDIGO标准诊断AKI，其漏诊率高达74.2%[2]。血肌酐与尿量指标的局限性在于：血肌酐水平会受到个体的肌肉含量、血容量、检测干扰以及药物和感染等因素的影响。同时个体的尿量也可能受到药物或是尿路梗阻等因素影响。对于慢性肾脏疾病的患者，设定血肌酐的基线值并不是一直有效，因为无法区分血肌酐的升高是由于慢性肾脏疾病所致还是AKI造成的，对慢性肾脏疾病与AKI的鉴别带来了混淆。血清肌酐和尿量作为AKI评价标准所存在的不足也促使了近十年来对于AKI标志物研究的发展。Endre等在第十届急性透析质量会议上建议使用“功能改变”和“肾脏损伤”这两个标准来诊断和评价AKI，将标志物纳入AKI诊断标准中[3]。本文就针对肾脏功能改变以及代表肾脏损伤的一些标志物进行一些简要介绍。

1 评价肾脏功能性恶化标志物

能够评价肾脏功能改变的指标主要有血肌酐、血清胱抑素C(cystatin C)以及尿液中的β2微球蛋白、α1微球蛋白以及微量白蛋白[4]。血肌酐和血cystatin C常用于计算肾小球滤过率。由于cystatin C是一个具有稳定生成速率，并且可自由透过肾小球，因此它被认为是一种较好的测定肾小球滤过功能的内源性标志物。在国内一项针对心脏术后AKI早期诊断的研究中，发现血清cystatin C在 AKI诊断中准确性高(受试者工作曲线下面积为0.992)，相较于血清肌酐可以更早检测AKI[5]。Zhang等[6]通过对11个国家13项研究的荟萃分析总结了血cystatin C在AKI诊断中的性能，在亚组分析中显示入院10小时后的血cystatin C具有最佳的诊断准确性，合并诊断比值比为28.2(特异性为92%)。尿液中的中低分子蛋白以及尿液cystatin C主要反映肾小管功能受损。中低分子蛋白及cystatin C通常不会出现在尿液中，当尿蛋白水平升高时，由于重吸收的竞争抑制效应，出现在尿液中。尿Cystatin C对于肾小管早期损伤的价值在Herget-Rosenthal等研究中的评价优于其他的尿中低分子量蛋白。Herget-Rosenthal的研究表明尿cystatin C与α1微球蛋白水平的升高可以预测非少尿的急性肾小管坏死患者的不良预后[7]。由于不同体系间测定方法不同，cystatin C测定存在偏差，故而在多中心建立肾小球滤过率估算方程时需考虑cystatin C的标准化。

2 评价肾小管实质性损伤的标志物

肾小管酶标志物能够检测肾小管早期受损，它们在早期受损的肾小管细胞，尤其是从肾小管刷状缘或细胞内释放，随着AKI的进展以及肾小管上皮细胞的坏死，尿酶水平开始下降甚至消失[8]。常见的尿液中的肾小管酶包括尿液N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、碱性磷酸酶、α亚型谷胱甘肽巯基转移酶(α-GST)、丙氨酸氨基肽酶(APP)以及γ谷氨酰转肽酶(γGT)。尿液NAG是一种非血源性的酸性水解酶，主要来源于近曲小管上皮细胞中的溶酶体。尿液NAG分子量为140 kDa，它是对于近曲小管损伤非常敏感的生物标志物，由于近曲小管细胞溶酶体内含有丰富的NAG，当自身受损时，尿NAG的活性显著增高并且早于其他尿酶，对于小管损伤的早期诊断有较大价值[9]。临床中检测尿液NAG总酶活性，以对硝基苯-β-D-氨基葡萄糖苷(PNP-NAG)速率法为主。而尿液NAG同工酶测定则以双抗体夹心法最为适宜常规应用。

Westhuyzen等指出来源于肾小管刷状缘酶和肾小管胞浆酶均能够很好预测重症病房入院患者的AKI，无论是S3段近端小管和升支粗段Henle’s襻都在实验模型中对缺氧损伤很敏感[8，10]。尽管α-GST(位于近端肾小管)及其同工酶π-GST(位于远端肾小管)是很好的预测肾小管损伤标志物，但目前主要通过ELISA试剂盒检测。而定位于肾小管S3段的碱性磷酸酶以及来源于小管刷状缘的γGT由于检测方式更为广泛使用，作为检测的标志物实际更常用[11]。

尿液中的APP主要来源于肾脏近曲小管刷状缘，血中该成分通常不通过肾小球基底膜。因此尿中的APP主要来自于肾脏，反映肾小管损伤程度。Westhyzen等的研究显示，升高的APP和尿NAG水平与较差的临床预后有关[10]。然而也有一些研究指出尿酶释放的阈值可能太低，在一些还没有进展到肾脏实质损伤的患者尿液中也可以检测到尿酶。因此很难解释一些并未发展为AKI的患者也出现尿酶升高的现象。

通过尿液中表达升高的蛋白也可以检测AKI。表达于近曲小管的蛋白尿肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、在肾脏表达的以共价键形式结合中性粒细胞中的明胶酶中性中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)以及表达在近端小管上皮细胞上的糖基化跨膜蛋白肾损伤分子(KIM-1)，均为AKI的敏感标志物。在缺血性损伤时，KIM-1、L-FABP以及NGAL表达均有上调，其机制可能与肾小管内显著增高的游离脂肪酸及其氧化产生的过氧化物造成细胞内ATP衰竭和氧化应激有关。

Matsui等指出L-FABP是一种能有效早期诊断AKI的肾小管损伤的类生物标志物。转基因鼠研究发现尿液中L-FABP含量与肾小管间质损伤呈正相关[12]。Portilla等在40例经心脏搭桥手术患者术后检测尿液中L-FABP，在术后4小时和12小时，L-FABP分别增加了94倍和45倍。用单因素回归分析表明体外循环时间和尿中L-FABP水平都是预测AKI的独立危险因素。而去除循环时间的影响，使用多元逻辑回归模型，术后4小时尿液L-FABP水平是预测AKI的独立因素，并且在采用尿L-FABP水平增高24倍时，其曲线下面积(AUROC)为0.81，敏感性为0.714，特异性为0.685[13]。同样Schley等在110例经心肺旁路手术的患者中检测尿液标志物L-FABP，其4小时尿液L-FABP水平有一定诊断能力[14]。

NGAL由远端肾单位产生，它是一个离子转运单位，当肾脏损伤时其表达上调。NGAL指标会受到多种因素影响，如炎症性疾病、代谢类疾病，肿瘤以及慢性肾脏疾病均会引起NGAL水平的升高。可以调节NGAL表达的因素包括炎症前细胞因子：白介素、肿瘤坏死因子α以及干扰素和维生素如视黄酸[15]。Wagener 研究组检测了426例成年接受心脏手术的患者，所有患者尿液NGAL均在术后升高，其水平与体外循环时间以及主动脉阻断次数显著相关。推测体外循环术所导致的炎症反应引起了NGAL水平的升高[16]。Endre的团队所进行的纳入529例患者的前瞻性队列研究中，所有标志物的AUC都低于0.7，当校正了肾功能的基线值以及检测标志物的时间后，其诊断性能提高，而NGAL在eGFR为90～120 ml/min并且在入院6小时内检测时或者在eGFR小于60 ml/min并在入院后12～36小时检测这两个条件下，该指标预测AKI的能力最好[17]。

KIM-1在肾脏组织细胞中主要表达为KIM-1b亚型，KIM-1在正常的肾脏并不表达，当肾脏损伤时，主要表达在近端上皮细胞，尤其是近端小管S3段。由于在其他组织表达的KIM1不会引起尿液中含量的升高，故而认为尿液KIM-1水平主要受肾脏源性影响，对肾小管损伤具有高度特异性[18]。Endre团队的队列研究表明KIM1在eGFR为90～120 ml/min并且在入院6～12小时检测时，其预测AKI的诊断效能最好[17]。Shao等通过对11项研究(包括五个前瞻性队列研究、2个横断面研究以及四个病例对照研究)的荟萃分析，总结了KIM-1对于AKI的诊断性能，合并敏感性达到74% (95%CI：61.0%～84.0%)，合并特异性达到86% (95%CI：74.0%～93.0%)，ROC曲线下面积为0.86(0.83～0.89)[19]。Ismail等的研究表明KIM-1缺陷的肾小管上皮细胞不能通过适应性免疫清除凋亡细胞和坏死细胞碎片，而这个过程是通过KIM-1与异三聚体G12α蛋白结合所介导的，该研究表明KIM-1通过抑制Gα12对肾缺血再灌注损伤进行内源性保护[20]。在CKD中KIM-1主要与炎症和纤维化区域共表达，它与肾移植的纤维化直接相关。实验表明不同于在AKI中的保护作用，在CKD中KIM-1的持续性表达通过激活固有免疫系统和募集中性粒细胞，促使慢性炎症导致肾脏纤维化[21]。近来采用试纸条检测KIM-1的方法为评估KIM-1水平提供了更简化的方式[22]。

一些细胞因子如白介素18(IL-18)也是急性肾小管坏死的一个非常敏感的指标，但由于心力衰竭会导致血浆IL-18升高，而IL-18可以通过肾小球滤过膜。因此尿液IL-18(μIL18)水平的升高并不是早期预测AKI的特异性指标，可能只表示肾脏损伤或者引起AKI的原因。Haase在他的前瞻性队列研究认为uIL18并不能预测心脏手术后突发的AKI，指出uIL18可以作为一个非特异性指标预测心肺旁路术相关的全身感染[23]。Liang的研究指出将uIL18指标与尿液中KIM-1指标结合作为预测AKI进展的一个指标[24]。一项多中心研究针对心脏术后的儿童患者，术后uIL18的水平与AKI的严重程度相关，术后6小时uIL18水平达到峰值，当cutoff值取354 pg/ml时，AUROC为0.72[25]。而Endre团队指出IL-18在eGFR为90～120 ml/min并且在入院6～12小时检测时或者入院后12～36小时检测其eGFR小于60 ml/min，该指标预测AKI的能力最好[17]。

一些细胞周期阻滞蛋白，如金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP2)以及胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)也在AKI早期表达升高[26]。TIMP2是分子量为21 kDa的非糖基化蛋白质，抑制基质金属蛋白酶，促进纤维化并且抑制内皮细胞的增殖。TIMP2参与细胞周期停滞，而细胞周期停滞在损伤早期出现，因此可以预测AKI的发生。IGFBP7是表达于血管内皮细胞上，与胰岛素以及胰岛素样因子结合的蛋白。IGFBP7可以抑制血管内皮的再生，并且与TIMP2作用机制类似，IGFBP7可以诱导细胞周期停滞于G1期，因此可以早期诊断AKI[4]。富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)通过对细胞周期的影响在肾小管上皮细胞损伤过程中起到作用。有研究者通过构建转染了Cyr61蛋白的肾小管上皮细胞，证实Cyr61蛋白可通过粘附激酶(FAK)途径促进CDK2表达，从而使细胞在S期时相延长，抑制细胞的凋亡，在缺氧时肾小管细胞Cyr61表达增加，因而推测Cyr61对肾小管上皮细胞缺氧损伤有一定的保护作用。进一步通过Western印迹法表明缺氧状态对Akt/ERK信号通路及BAD蛋白表达的影响[27]。

不同类型的标志物可以从不同程度上反映内源性肾损伤和功能性肾损伤的等级。比如尿液标志物可能对于病理性的肾损伤更为敏感，而血清中的标志物对于清除率改变更为敏感。目前对于AKI的诊断标准并不统一，很多研究的标准是建立在血肌酐正常的情况下，采用某项标志物水平升高提示AKI。因此提高了诊断敏感性但却牺牲了特异性和阳性预测值。然而在缺乏AKI的金标准的同时，医师很难在临床上区分内源性肾损伤(病理上的AKI)和生理上的肾灌注量下降(功能性的肾损伤)，加上存在着病理上AKI与功能性肾损伤并存的灰色地带。这些无法统一的标准给评价生物标志物的诊断能力带来挑战。尽管如此，多标志物的运用可以在患者肾小球滤过率尚未明显下降时，对多并发症的重症患者AKI发生的风险进行预估，避免一些肾毒性药物的使用并且可以指导输液的选择，因此通过卫生经济学评价以及诊断能力评估选择合适的标志物以及该标志物最佳的检测时间纳入AKI集束化管理可能帮助提高患者的预后。

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Advances in biomarkers for acute kidney injury

YUXia-lian，WANGWei-ming
(InstituteofNephrology&DepartmentofNephrology，AffiliatedRuijinHospital，SchoolofMedicine，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200025，China)

WANGWei-ming

Acute kidney injury (AKI) is a common disease with high mortality among hospitalized patients，especially patients in ICU.Recently，many experts focused on the novel biomarkers applied to assist diagnosis and monitoring AKI as an approach to improve the outcome of the patients.This review shortly introduces the advances in some AKI biomarkers for changes in kidney function and kidney injury.

Biomarker；Acute kidney injury

国家自然科学基金资助项目(编号：81270782，30771000)，国家重点基础研究发展计划(973计划)(编号：2012CB517701)，上海市卫计委重中之重学科建设项目国家临床重点专科建设项目，转化医学协同创新中心合作研究项目

王伟铭，男，博士，主任医师，博士生导师。中华医学会肾脏病分会常委，中国中西医结合肾脏病分会委员。主要研究方向：肾脏病的临床和基础研究，生物标记物在肾脏疾病中的探索及应用，肾脏炎症、纤维化等在肾脏疾病进展中的作用机制及防治研究。

R692

A

1672-6170(2017)02-0004-04

2016-12-23)