成纤维细胞生长因子21对胰岛素抵抗肝细胞葡萄糖摄取的影响及机制

白洁，王金鑫，宋紫暄，吴志敏，高雁，朱泽，李光明(天津医科大学，天津00070；武警广西总队医院；天津市美联博科技有限公司)



成纤维细胞生长因子21对胰岛素抵抗肝细胞葡萄糖摄取的影响及机制

白洁1，王金鑫1，宋紫暄1，吴志敏2，高雁3，朱泽1，李光明1
(1天津医科大学，天津300070；2武警广西总队医院；3天津市美联博科技有限公司)

目的 观察体外合成成纤维细胞生长因子21(FGF21)对胰岛素抵抗(IR)肝细胞葡萄糖摄取的影响，并探讨其机制。方法 体外合成具有一定稳定性的荧光标记的FGF21 mRNA。将肝细胞置于含34.4 μg/mL重组胰岛素和1 μg/mL地塞米松及10% FBS的RPMI-1640培养基中培养72 h，诱导建立IR肝细胞模型，将其分为模型对照组，胰岛素组和FGF21组。模型对照组不添加任何药物，胰岛素组加入1 μg/mL重组胰岛素，FGF21组电转入FGF21 mRNA。采用葡萄糖氧化酶法测定3组细胞培养液中的葡萄糖含量，计算葡萄糖吸收量；实时荧光定量PCR方法检测3组葡萄糖转运蛋白1(GLUT1) mRNA表达，Western blotting法检测3组GLUT1蛋白表达。结果 与模型对照组相比，FGF21组葡萄糖吸收量升高，细胞GLUT1 mRNA及蛋白表达升高(P均<0.05)。与模型对照组相比，胰岛素组葡萄糖吸收量不明显，细胞GLUT1 mRNA及蛋白表达无明显差异(P均>0.05)。结论 体外合成的FGF21 mRNA可以改善IR肝细胞对葡萄糖的摄取，其机制与增加GLUT1表达有关。

成纤维细胞生长因子21；葡萄糖转运蛋白1；体外转录mRNA;葡萄糖摄取；胰岛素抵抗；肝细胞

胰岛素抵抗(IR)是胰岛素的外周靶组织对内源性或外源性胰岛素的敏感性和反应性降低，导致生理剂量的胰岛素产生低于正常的生理效应。IR是多种代谢性疾病包括高血压、血脂异常、冠心病、脑血管疾病伴2型糖尿病(T2DM)等发生的危险因素。成纤维细胞生长因子21(FGF21)是FGF家族成员，主要在肝脏中表达，以内分泌方式在体内发挥作用[1]。FGF21具有调节动物体内葡萄糖代谢平衡的作用。Berglund等[2]报道，FGF21可以缓解肥胖糖尿病模型小鼠的IR，持续调节体内糖脂代谢，刺激机体糖吸收，且不依赖胰岛素的参与，可用于IR相关的T2DM治疗。体外转录mRNA是新型的基因分子药物类型，对比质粒DNA与病毒载体，无基因插入突变的风险，无免疫原性问题。葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)是机体分布最广的葡萄糖转运体，是人体转运葡萄糖的主要载体，与代谢紧密相关，主要功能是调节葡萄糖摄取[3]。2016年5～10月，我们对IR细胞模型电转入体外合成的FGF21 mRNA，观察其能否改善IR细胞模型的葡萄糖摄取，为其用于T2DM的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 质粒PT7TS-FGF21、T7-GFP由本实验室构建保存。正常人肝细胞L02由天津医科大学解剖学实验室惠赠。RPMI-1640培养基购自Hyclone公司，FBS购自Invitrogen公司，T7 RNA快速高效合成试剂盒购自Ambion公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒、FastQuant RT Kit和SYBR Green PCR Master Mix购自天根生化科技有限公司，葡萄糖检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，重组人胰岛素、地塞米松、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL发光液购自北京索莱宝公司。兔抗人、山羊抗兔IgG二抗和β-actin购自Abcam公司，限制性内切酶SpeⅠ、SalⅠ和EcoRⅤ购自TransGen Biotech公司。引物合成于GENEWIZ公司。

1.2 IR模型细胞的建立 参照文献[4, 5]方法。取对数生长期肝细胞接种于96孔板，加入含20% FBS的RPMI-1640培养基，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h至细胞贴壁。将细胞加入含34.4 μg/mL重组胰岛素和1 μg/mL地塞米松及10% FBS 的RPMI-1640培养基中培养72 h，诱导建立IR肝细胞模型。

1.3 FGF21 mRNA的体外合成 构建质粒PT7TS-FGF21-GFP，从T7-GFP质粒中扩增GFP基因，其上游引物为5′-CTGTCGAC (SalⅠ) ACTCACTATAGGGCC-3′、下游引物为5′-CGGATATC (EcoRⅤ) CTTTACTTGTACAGCTC-3′。 PCR反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次;72 ℃ 10 min。连接PT7TS-FGF21载体双酶切载体片段与GFP回收片段，转化后扩增重组质粒;经双酶切鉴定后，按照T7 RNA快速高效合成试剂盒进行体外转录。

1.4 IR肝细胞的分组与处理 将IR肝细胞分为模型对照组、胰岛素组和FGF21组。模型对照组不给予任何药物，胰岛素组加入1 μg/mL重组胰岛素，FGF21组电转入FGF21 mRNA。FGF21 mRNA向IR肝细胞转染的方法：取IR肝细胞加入胰酶消化，加入5 mL PBS制成单细胞悬液，室温离心，去上清，加入1 mL OPTI-MEM重悬细胞为2.5×107/mL。加入30 μg待转染FGF21 mRNA至重悬细胞液，转移细胞液至相应规格的电转杯，电转细胞分为3组，电转参数分别为500 V 500 μs、400 V 500 μs、300 V 500 μs。电击后，电转杯置于恒温培养箱中5～10 min，将细胞悬液转移至预热的培养基中培养24 h。待细胞贴壁后，荧光倒置显微镜下观察GFP的表达(即转染效率)，结果显示电转参数为500 V 500 μs条件下细胞的转染率为85%，细胞存活率为75%，显著高于400 V 500 μs与300 V 500 μs两组。因此选取500 V 500 μs进行电转。3组均在20%FBS RPMI-1640培养基37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h。

1.5 肝细胞葡萄糖吸收量检测 取3组细胞培养液，采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)检测培养基中的葡萄糖含量。样本孔内加入10 μL样本和1 000 μL工作液，校准孔内加入10 μL校准液和1 000 μL工作液，空白孔内加入10 μL蒸馏水和1 000 μL工作液。将各孔混合液混匀后，置于37 ℃水浴锅反应10 min。酶标仪于波长505 nm处测定吸光度，利用空白孔调零。葡萄糖含量(mmol/L)=样本吸光度(A)/校准吸光度(A)×校准液浓度。以未接种细胞的20%FBS RPMI-1640培养基中的葡萄糖含量做对照，计算各组葡萄糖吸收量。葡萄糖吸收量=(20%FBS RPMI-1640培养基葡萄糖标准含量-样本培养液葡萄糖含量)/20%FBS RPMI-1640培养基葡萄糖标准含量×100%。

1.6 肝细胞GLUT1 mRNA表达检测 用TRIzol试剂盒提取3组细胞总RNA，反转录合成cDNA。采用实时荧光定量反应检测细胞GLUT1 mRNA，以β-actin作为内参，按照SYBR Green PCR Master Mix试剂说明书操作。GLUT1上游引物5′-CGTGCTTATGGGTTTCTCCAAA-3′，下游引物5′-GACACCTCCCCCACATACATG-3′，扩增片段123 bp。β-actin上游引物5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下游引物5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′，扩增片段500 bp。反应条件：94 ℃ 1 min，94℃ 30 s，64 ℃ 30 s，共30次循环。读取Ct值，采用2-ΔΔCt法计算GLUT1 mRNA的相对表达量。

1.7 肝细胞GLUT1蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集3组细胞提取总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白样品经上样，SDS-PAGE电泳分离，300 mA 2 h电转PVDF膜上。5%脱脂牛奶TBST中室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)兔抗人GLUT1，4 ℃放置过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔IgG(1∶3 000)，室温孵育1 h。HRP-ECL发光法，曝光，浸入显影液中1～2 min，清水漂洗后用Bio-Rad图像分析系统扫描条带，用Image J分析条带灰度。

2 结果

2.1 3组葡萄糖吸收量比较 模型对照组葡萄糖吸收量为0.38±0.07，胰岛素组为0.39±0.03，FGF21组为0.47±0.06。胰岛素组葡萄糖吸收量与模型对照组比较无统计学差异(P>0.05)，FGF21组较模型对照组升高(P<0.05)。

2.2 3组GLUT1 mRNA表达比较 模型对照组、胰岛素组、FGF21组GLUT1 mRNA的相对表达量分别为1、1.36±0.37、3.88±0.60。胰岛素组GLUT1 mRNA表达量与模型对照组比较无统计学差异(P>0.05),FGF21组较模型对照组升高(P<0.05)。

2.3 3组GLUT1蛋白表达比较 模型对照组、胰岛素组、FGF21组GLUT1蛋白表达量分别为0.44±0.01、0.55±0.01、0.75±0.01。胰岛素组GLUT1蛋白表达量与模型对照组比较无统计学差异(P>0.05)，FGF21组较模型对照组升高(P<0.05)。

3 讨论

T2DM作为一种多基因遗传性疾病，是环境因素和遗传因素共同作用的结果，其基本特征为胰岛β细胞功能缺陷和IR[6]。IR不仅是T2DM的发病机制之一，更贯穿于T2DM的发生、发展全过程。IR主要涉及到胰岛素的三个重要靶器官，即肝、骨骼肌和脂肪组织[7]。肝脏是胰岛素作用敏感位点，维持血糖稳定的重要器官。鉴于人正常肝细胞L02保留了人类肝细胞基本生物特性[8]，因此本研究选取L02来建立细胞模型，模拟了T2DM情况下细胞糖代谢状态，同时观察干预因素对模型细胞IR状态下的糖代谢的影响，筛选提高胰岛素敏感性的药物。有研究表明[9]，肿瘤本身也存在IR，与肝肿瘤细胞相比，本研究中采用L02正常肝细胞建立IR肝细胞模型，能够减少干扰因素，获得更可靠的实验结果；且与动物模型相比，具有价格低、周期短、重复性强等优点。

FGF21与机体糖脂代谢的调节密切相关。实验[10, 11]证明，FGF21敲除小鼠体内糖异生减少，出现高血糖，小鼠体质量轻度增加，葡萄糖耐量降低；而FGF21过表达小鼠体质量减轻，葡萄糖耐量增加。近年来，FGF21作为糖尿病的治疗靶标，其降低糖尿病小鼠血糖、降低胰岛素使用浓度、显著改善糖尿病小鼠的肝脏胰岛素敏感度等相关特性逐渐为研究人员所关注。本研究的创新之处在于利用电转的方式使mRNA进入细胞来发挥其作用。电穿孔技术是目前体外转录mRNA进入细胞的普遍方法，与质粒DNA转染相比，mRNA电转对电子设置要求相对较低，对细胞的毒性较小。Van Tendeloo等[12]研究表明，mRNA电转细胞的存活率较高。本研究观察了不同条件下FGF21 mRNA的电转效率。结果显示，电转条件300、400、500 V时转染率均超过50%，其中500 V时细胞具有较高的存活率，以此作为优化实验选取的最佳条件。鉴于引起机体产生IR的因素包括高浓度胰岛素、糖皮质激素、游离脂肪酸及炎症因子等[13]，本研究模拟体内高浓度胰岛素状态，同时配合糖皮质激素的诱导作用，建立IR体外细胞模型，选用34.4 μg/mL重组胰岛素和1 μg/mL地塞米松。本实验采用GOD-POD检测细胞对葡萄糖的摄取量，对比经典的需要放射性同位素3H或14C标记参与的葡萄糖摄取实验，污染小、经济，不需要特殊仪器，且细胞可以用于后续的实验[14]。为了研究FGF21促进IR模型肝细胞的葡萄糖摄取机制，我们检测了IR模型肝细胞L02中的GLUT1 mRNA和蛋白表达，结果显示FGF21 mRNA使模型细胞的GLUT1 mRNA和蛋白表达量显著提高，而GLUT1作为体内分布最多的葡萄糖转运载体，协助葡萄糖通过细胞膜。因此认为，FGF21 mRNA提高IR模型肝细胞葡萄糖摄取的作用可能与其增加GLUT1表达有关。

综上所述，我们首次将FGF21 mRNA电转入IR肝细胞模型，发现可以改善IR状态下肝细胞对于葡萄糖的摄取，说明FGF21对于血糖的维持有重要作用。这为T2DM患者带来了新的希望，将成为治疗T2DM的新型靶向基因分子药物类型。

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Effect of FGF-21 on glucose uptake of insulin-resistant liver cells

BAIJie1,WANGJinxin,SONGZixuan,WUZhimin,GAOYan,ZHUZe,LIGuangming

(1TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To observe the effect of fibroblast growth factors-21 (FGF21) on glucose uptake of insulin-resistant (IR) liver cells. Methods The fluorescently labeled FGF21 mRNA with certain stability was synthesized in vitro. The liver cells were cultured for 72 h in RPMI-1640 medium supplemented with 34.4 μmol/L recombinant insulin and 1 μmol/L dexamethasone to establish IR cell models, and then IR cell models were divided into the model control group, insulin group, and FGF21 group. We did not add any drugs into the model control group. The insulin group was treated with 1 μmol/L recombinant insulin and FGF21 group was transfected with FGF21 mRNA. The cell glucose uptake in the three groups was measured by glucose oxidase (GOD-POD) assay. The mRNA and protein expression of glucose transporter 1 (GLUT1) was detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting. Results Compared with the model control group, the glucose uptake of the FGF21 group increased and the expression of GLUT1 mRNA and protein increased (allP<0.05).Compared with the model control group, the glucose uptake of the FGF21 group did not change significantly in the insulin group, and no significant difference was found in the GLUT1 mRNA and protein expression as compared with that of the model control group (allP>0.05). Conclusion FGF21 mRNA synthesized in vitro can improve the glucose uptake of IR liver cells, and its mechanism is related to the increase of GLUT1 expression.

fibroblast growth factors-21; glucose transporter 1; in vitro transcription of RNA; glucose uptake; insulin resistance; hepatic cells

天津市科技计划项目(14ZCZDCX00054)。

白洁(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向为基因转录的机制及疾病的生物治疗。E-mail: baijiexyz@163.com

李光明(1978-)，男，讲师，主要研究方向为mRNA的合成与表达。E-mail: li-guangming@hotmail.com

朱泽(1967-)，男，教授，主要研究方向为基因的转录机制及疾病的生物治疗。E-mail: zhuze@tijmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.002

Q81

A

1002-266X(2017)26-0005-04

2016-12-27)