三溴丙酮酸对结肠癌HCT-8/V细胞增殖及其mdr1基因、P-gp蛋白表达的影响

李浩，戴世龙，许博文，赵宇，张青松

(1华北理工大学附属开滦总医院,河北唐山 063000；2华北理工大学研究生学院)

三溴丙酮酸对结肠癌HCT-8/V细胞增殖及其mdr1基因、P-gp蛋白表达的影响

李浩1，戴世龙1，许博文1，赵宇2，张青松1

(1华北理工大学附属开滦总医院,河北唐山 063000；2华北理工大学研究生学院)

目的探讨三溴丙酮酸(3-BrPA)对结肠癌HCT-8/V耐药细胞株细胞增殖及mdr1基因和P-糖蛋白(P-gp)蛋白表达的影响。方法取结肠癌HCT-8/V耐药细胞株、HCT-8细胞株，设置为对照组，10、20、40、80 mg/L长春新碱组及50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA组，对照组加入PBS，10、20、40、80 mg/L长春新碱组分别加入10、20、40、80 mg/L长春新碱，50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA组分别加入50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA。应用MTT法测算3-BrPA及长春新碱干预后HCT-8/V、HCT-8细胞存活率。应用RT-PCR及Western blotting技术检测3-BrPA作用HCT-8/V细胞后mdr1基因及P-gp蛋白表达。结果24 h后，长春新碱组与对照组相比，HCT-8、HCT-8/V细胞存活率降低(P均lt;0.01)；3-BrPA组与对照组相比，细胞存活率均降低(P均lt;0.01)。HCT-8、HCT-8/V mdr1基因相对表达量分别为1.000±0.000、10.539±1.814，Plt;0.01。HCT-8/V细胞经0、75、125 μmol/L 3-BrPA处理24 h后,mdr1基因相对表达量分别为1.000±0.000、0.733±0.058、0.542±0.103，不同浓度3-BrPA作用后mdr1基因的相对表达量比较，P均lt;0.01。HCT-8、HCT-8/V细胞P-gp相对表达量分别为0.044±0.036、1.665±0.188，Plt;0.01。HCT-8/V细胞经0、75、125 μmol/L 3-BrPA处理24 h后，P-gp相对表达量分别为1.441±0.259、1.140±0.252、0.618±0.274，0、125 μmol/L 3-BrPA处理后P-gp表达比较，Plt;0.01。结论3-BrPA可抑制结肠癌HCT-8/V细胞增殖，降低mdr1基因及P-gp蛋白表达。

结肠癌;三溴丙酮酸;长春新碱;多药耐药；细胞增殖

肿瘤的多药耐药(MDR)是肿瘤患者化疗失败的主要原因之一，并对患者的化疗效果产生严重影响。肿瘤耐药的机制复杂，细胞编码的MDR基因mdr1及位于细胞表面P-糖蛋白(P-gp)的高表达被认为是耐药的主要原因之一[1]。P-gp得以维持正常的生理功能依赖于胞质内ATP的供应，减少ATP的产生是否可逆转肿瘤的耐药成为研究热点。三溴丙酮酸(3-BrPA)是近年发现的新型抗肿瘤药物[2]。以往研究表明，3-BrPA抗肿瘤的作用机制主要通过抑制糖代谢关键酶的活性以减少细胞ATP的产生、降低线粒体膜电位并可激活细胞氧化应激，诱导细胞凋亡、死亡或自噬的发生，从而对肿瘤发挥杀灭作用[3～6]。对是否可通过减少ATP产生而抑制多药耐药蛋白P-gp的表达以克服耐药目前尚不明确。2016年10月～2017年5月，我们通过3-BrPA处理结肠癌耐药细胞株HCT-8/V及非耐药细胞株HCT-8，研究3-BrPA对细胞增殖及MDR基因mdr1、P-gp表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌耐药细胞株HCT-8/V(南京凯基生物公司)；非耐药细胞株HCT-8(中科院上海细胞库)；3-BrPA和长春新碱(大连美仑生物公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司；TRIzol试剂及引物合成由Invitrogen公司完成；RT-PCR逆转录及荧光定量扩增试剂盒(TaKaRa公司)。兔抗人ABCB-1(P-gp)单克隆抗体(Abcam公司)；HRP标记的山羊抗鼠/兔(美国KPL公司)；β-actin(Arigo公司)。QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System(Life公司)；ECL显影仪(Tanon-5200，北京原平皓生物技术有限公司)。

1.2 细胞培养 将人结肠癌耐药细胞株HCT-8/V及非耐药细胞株HCT-8以含10%胎牛血清(FBS)及1%双抗(青、链霉素)的RPMI1640培养基常规培养，每周换液3～4次，待细胞生长至70%～80%密度时按照1∶2比例传代继续培养。RPMI1640培养基加入含有终浓度为2 mg/L的长春新碱以维持HCT-8/V细胞耐药性，并于实验前2周更换为不含长春新碱的RPMI1640培养基继续培养。

1.3 细胞存活率检测 采用MTT法。胰酶消化后以1×104/孔细胞数接种于96孔板中，每孔200 μL。设置为对照组，10、20、40、80 mg/L长春新碱组及50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA组，对照组加入PBS，10、20、40、80 mg/L长春新碱组分别加入10、20、40、80 mg/L长春新碱，50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA组分别加入50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA，培养24 h，每孔加入15 μL MTT(5 mg/mL)试剂，37 ℃放置4 h，弃上清，加入150 μL DMSO以溶解蓝紫色结晶。摇床上振荡10 min，490 nm波长处以酶标仪检测光密度(OD)值。细胞存活率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。每组实验重复3次。

1.4 HCT-8/V、HCT-8细胞中mdr1表达检测 采用RT-PCR法。3-BrPA组处理细胞24 h后，TRIzol法提取细胞总RNA，鉴定RNA质量，纯度在1.8～2.1。RT-PCR引物序列(Invitrogen公司合成)如下：mdr1正向引物：5′-CACTGGAGCATTGACTACC-3′，反向引物：5′- GCCAACCATAGATGAAGGAT-3′；β-actin正向引物：5′-TGAAGTGTGACGTGGACATC-3′，反向引物：5′-GGAGGAGCAATGATCTTGAT-3′。逆转录及荧光定量扩增步骤依据TaKaRa试剂盒说明书进行，扩增条件为95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;60 ℃ 34 s;共40个循环。选用β-actin基因作为内参照，采用2-ΔΔCT法进行数据分析。荧光定量产物选用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳验证。

1.5 HCT-8/V、HCT-8细胞中P-gp表达检测 采用Western blotting法。各组细胞经3-BrPA处理24 h，提取总蛋白并定量，与上样缓冲液混合后煮沸备用。电泳、转膜、室温封闭2 h，4 ℃孵育一抗过夜，二抗室温孵育2 h，ECL显影。所用一抗为ABCB1(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，二抗为山羊抗兔/鼠(1∶5 000)。所得图像灰度值分析利用Image J软件，数据处理以目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值作为蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 HCT-8/V与HCT-8细胞存活率比较 经0、10、20、40、80 mg/L长春新碱处理24 h，HCT-8细胞存活率分别为100.00%±0.00%、93.63%±5.19%、64.09%±3.57%、45.01%±4.56%、30.74%±3.28%；HCT-8/V细胞存活率分别为100.00%±0.00%、92.74%±2.00%、92.40%±3.49%、88.15%±2.76%、82.56%±4.65%。经0、50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA处理24 h，HCT-8细胞存活率分别为100.00%±0.00%、86.01%±11.22%、45.18%±4.65%、19.10%±3.75%、9.53%±4.15%；HCT-8/V细胞存活率分别为100.00%±0.00%、90.02%±13.29%、78.69%±7.89%、42.86%±14.73%、29.05%±10.42%。长春新碱作用于两种细胞24 h，HCT-8细胞存活率和对照组相比均降低，且呈浓度依赖性(P均lt;0.01)；HCT-8/V细胞存活率和对照组相比均降低(F=27.28,Plt;0.01)。HCT-8/V及HCT-8细胞存活率经3-BrPA处理24 h后均降低(P均lt;0.01)。

2.2 HCT-8/V、HCT-8细胞mdr1基因相对表达量比较 HCT-8、HCT-8/V细胞mdr1基因相对表达量分别为1.000±0.000、10.539±1.814，Plt;0.01。 HCT-8/V细胞经0、75、125 μmol/L 3-BrPA处理24 h后,mdr1基因相对表达量分别为1.000±0.000、0.733±0.058、0.542±0.103，不同浓度3-BrPA作用后mdr1基因的相对表达量比较，P均lt;0.01。

2.3 HCT-8/V、HCT-8细胞中多药耐药蛋白P-gp表达比较 HCT-8、HCT-8/V细胞P-gp相对表达量分别为0.044±0.036、1.665±0.188，Plt;0.01。HCT-8/V细胞经0、75、125 μmol/L 3-BrPA处理24 h后，P-gp相对表达量分别为1.441±0.259、1.140±0.252、0.618±0.274，0、125 μmol/L 3-BrPA处理后P-gp表达比较，Plt;0.01。

3 讨论

临床肿瘤患者化疗失败的主要原因之一归因于肿瘤产生了MDR，肿瘤产生耐药的主要机制之一与mdr1(ABCB-1)基因所表达的P-gp蛋白增加有关，除此之外还有肺癌耐药蛋白(LCRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等高表达。这些蛋白具有能量依赖性，均属于ATP结合盒(ABC)膜转运蛋白超家族[7]。在研究肿瘤耐药机制过程中，P-gp是第一个被发现的ABC蛋白,是一种相对分子质量为170 kD的跨膜糖蛋白，由位于人染色体7q21.的mdr1基因所编码形成。两条单一相似的多肽链组成了P-pg的高级结构，1个ATP结合结构域和6个跨膜α螺旋区组成了单一多肽链，药物的转运通道及结合位点由跨膜结构域组成，ATP结合位点为药物的转运提供所需能量[1,8]。3-BrPA是近年发现的新型有效抗肿瘤药物，相关研究表明，肿瘤细胞膜表面高表达的单羧酸转运蛋白-1(MCT-1)为3-BrPA进入细胞的通道，因此3-BrPA可相对特异性地作用于肿瘤细胞而对正常细胞不产生影响[9]。目前研究表明，3-BrPA主要抗肿瘤作用是通过抑制糖酵解关键酶的活性以使肿瘤组织ATP的产生减少，线粒体膜电位降低，同时可使肿瘤的生长受到抑制并促进其凋亡[10]。

Sadowska-Bartosz等[11]研究结果表明，对于高表达ABCB1的MDCK-Ⅱ细胞，3-BrPA有更明显的选择性抑制作用，ATP水平减少更明显，从而使高表达ABCB1的MDCK-Ⅱ细胞表现出更好的3-BrPA治疗效果。对于ABC高表达的恶性肿瘤SP细胞，3-BrPA可通过抑制糖酵解使ABC转运蛋白失活而克服其耐药性[12]。3-BrPA可降低耐药细胞mdr1基因及多药耐药蛋白P-gp水平[13]。3-BrPA可使乳腺癌耐药细胞MCF-7/ARD对表柔比星表现较为敏感，减少药物的外排并使ATP的产生受到抑制。

近年3-BrPA的研究主要集中于进入细胞的单羧酸转运蛋白的依赖性、诱导肿瘤凋亡及相关通路，目前关于3-BrPA克服肿瘤耐药的确切机制尚知之甚少。本研究结果显示，对结肠癌正常细胞及耐药细胞，3-BrPA均可抑制其生长，并可逆转肿瘤耐药。耐药细胞株mdr1基因及P-gp蛋白表达均明显高于非耐药细胞，3-BrPA作用于结肠癌耐药细胞后，mdr1基因及P-gp蛋白表达均下降，并且具有浓度依赖性。

综上所述，3-BrPA可克服耐药细胞的生长并可逆转耐药，其机制可能和减少肿瘤细胞ATP的产生，从而抑制多药耐药基因及蛋白表达有关。

[1] Chen CJ, Chin JE, Ueda K, et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr 1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells[J]. Cell, 1986,47(3):381-389.

[2] Azevedosilva J, Queirós O, Baltazar F, et al. The anticancer agent 3-bromopyruvate: a simple but powerful molecule taken from the lab to the bedside[J]. J Bioenerg Biomembr, 2016,48(4):349-362.

[3] Chen Z, Zhang H, Lu W, et al. Role of mitochondria-associated hexokinase II in cancer cell death induced by 3-bromopyruvate[J]. BBA Bioenergetics, 2009,1787(5):553-560.

[4] Guo X, Zhang X, Wang T, et al. 3-Bromopyruvate and sodium citrate induce apoptosis in human gastric cancer cell line MGC-803 by inhibiting glycolysis and promoting mitochondria-regulated apoptosis pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,475(1):37-43.

[5] Konstantakou EG, Voutsinas GE, Velentzas AD, et al. 3-BrPA eliminates human bladder cancer cells with highly oncogenic signatures via engagement of specific death programs and perturbation of multiple signaling and metabolic determinants[J]. Molecular Cancer, 2015,14(1):135.

[6] Ganapathykanniappan S, Geschwind JF, Kunjithapatham R, et al. 3-Bromopyruvate induces endoplasmic reticulum stress, overcomes autophagy and causes apoptosis in human HCC cell lines[J]. Anticancer Research, 2010,30(3):923-935.

[7] Dean M, Hamon Y, Chimini G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily[J]. J Lipid Res, 2001,11(7):1156-1166.

[8] Cole SPC. Multidrug Resistance Protein 1 (MRP1, ABCC1), a quot;Multitaskingquot; ATP-binding Cassette (ABC) Transporter[J]. J Biol Chem, 2014,289(45):30880-30888.

[9] Birsoy K, Wang T, Possemato R, et al. MCT1-mediated transport of a toxic molecule is an effective strategy for targeting glycolytic tumors[J]. Nature Genetics, 2013,45(1):104-108.

[10] Nelson K. 3-Bromopyruvate kills cancer cells in animals[J]. Lancet Oncology, 2002,3(9):524.

[11] Sadowska-Bartosz I, Grbowski J, Kpka E, et al. ABCB1-overexpressing MDCK-II cells are hypersensitive to 3-bromopyruvic acid[J]. Life Sciences, 2016,162:138-144.

[12] Nakano A, Tsuji D, Miki H, et al. Glycolysis Inhibition Inactivates ABC Transporters to Restore Drug Sensitivity in Malignant Cells[J]. PLoS One, 2011,6(11):e27222.

[13] 唐青,胡义德.3-BrPA对肺癌A549/DDP细胞耐药的逆转作用研究[J].中华肺部疾病杂志(电子版),2016,9(2):145-149.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.012

R735.35

A

1002-266X(2017)41-0039-03

唐山市科技支撑项目(14130260)。

张青松(E-mail:klyy888888@163.com)

2017-07-10)