紧密连接相关蛋白对血脑屏障通透性影响的研究进展

张楠，王思迪，涂盼春，岳英芳，杨智航

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2013级7班，辽宁 沈阳 110034；2.麻醉学专业2013级2班；3.2012级英文2班；4.2013级6班；5.生理学教研室）

紧密连接相关蛋白对血脑屏障通透性影响的研究进展

张楠1，王思迪2，涂盼春3，岳英芳4，杨智航5*

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2013级7班，辽宁 沈阳 110034；2.麻醉学专业2013级2班；3.2012级英文2班；4.2013级6班；5.生理学教研室）

血脑屏障作为机体中重要的组织结构，对于维持脑组织的安全及稳定具有十分重要的作用，紧密连接是血脑屏障的重要组成部分，其相关蛋白在维持紧密连接的稳定性和血脑屏障通透性方面同样至关重要。

紧密连接；血脑屏障；紧密连接相关蛋白

血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是人体的重要组织结构，是脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障以及由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障。BBB限制血液中的某些物质进入脑，在很大程度上维持了脑组织内环境的基本稳定，这是中枢神经系统发挥正常生理调控功能的保证。脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）及细胞间的紧密连接（tight junctions，TJs）是构成BBB的主要结构［1］，TJs是由相邻细胞膜外层通过特异性的跨膜蛋白彼此融合构成的闭锁结构，位于BMECs间，主要由跨膜蛋白（闭合蛋白Claudins家族、咬合蛋白Occludin家族、连接黏附分子JAMs）、胞质附着蛋白ZOs家族、细胞骨架蛋白（F-actin）等多种蛋白构成。TJs调控的细胞旁途径和caveolae介导的跨细胞途径可以调节BBB的通透性［2］。紧密连接相关蛋白的结构、分布和表达水平的变化，都将导致TJs的开放或关闭，从而改变BBB的通透性。本文旨在探讨紧密连接相关蛋白对BBB通透性的影响。

1 紧密连接相关蛋白的分类及组成

1.1 跨膜蛋白

1.1.1 闭合蛋白Claudins Claudins蛋白是含有4个跨膜区域和2个细胞外环的跨膜紧密连接蛋白，相对分子质量为20～27 kDa，其跨膜或胞质部分决定紧密连接丝的构建，与细胞外结构域无关，相邻细胞膜中Claudins的细胞外环可以相互作用，从而封闭细胞间隙，这也是TJs的形成和离子通透选择性的原因之一［3］。Claudins蛋白在维持组织结构和功能中起到关键作用，它的异常表达可能造成TJs的改变，从而导致各种相关疾病的发生发展［4］。

目前至少已发现Claudin家族的24个成员，其中Claudins-3、5、12在脑毛细血管内皮细胞中高表达［5］，Claudin-5/TMVCF参与形成TJs，进而构成BBB，这在维持中枢神经系统稳态方面是至关重要的，但是这种高度选择性分子界面也限制了药物对神经退行性变性和神经系统疾病的干预治疗［6］。在体实验和体外实验证明，特定产气荚膜梭菌肠毒素的突变片段绑定到Claudin-5，可以调制的大脑血管渗透性［3］。

1.1.2 咬合蛋白Occludin Occludin是紧密连接相关蛋白中最具有代表性的蛋白质之一，直接参与TJs的屏障功能和栅栏功能。它的相对分子质量约60 kDa，有2个细胞外环和4个跨膜区域，其中第1个细胞外环和羧基端在不同种属间有高度同源性，相邻细胞间的环状结构可彼此作用于封闭细胞旁空间。Occludin的氨基端和羧基端均位于胞质内，氨基端对TJs的装配和屏障功能的保持起重要作用，羧基端与ZO-1蛋白直接相连，与ZO-1一起调节TJs的结构变化，对Occludin蛋白在TJs间的定位及细胞间的通透性调节具有重要作用。Occludin蛋白的移动范围主要是在细胞内，在细胞黏附和细胞调节等方面具有关键作用。有研究表明作为 BBB典型结构的Claudin、ZO-1、Occludin均匀分布在脑实质和脑血管的不同部分［7］。目前大多数学者认为Occludin的表达水平下降可能引起TJs的开放，增加BBB通透性。Diaz等［8］研究发现，局部缺血缺氧可以诱导Occludin表达水平下降，同时伊文思蓝溢出进入大脑实质，证实了BBB功能障碍，通透性增加。

1.1.3 连接黏附分子JAMs JAMs属于免疫球蛋白超家族成员，不仅在TJs部位上表达，也可以表达于白细胞和血小板。JAMs有JAM-1、2、3、4等4种类型，其中血管内皮细胞主要表达JAM-1、JAM-2和JAM-3，而JAM-1在BMECs高表达［9］。

JAM-1是细胞连接形成过程中首先出现在细胞间接触位点的分子，能募集其他蛋白以启动TJs形成［10］，在稳定细胞连接结构和降低旁细胞通路通透性方面发挥作用，且TJs完整性被破坏与JAM-1表达的降低有关［9，11］。此外，JAM-1还可以调节TJs的重装。研究发现在使用抗JAMs单克隆抗体后，不仅难以将JAM-1组装到TJs上，同时也阻断了Occludin的重新分布，从而阻碍了上皮屏障功能的恢复［11］。

1.2 胞质附着蛋白ZOs ZOs属于膜相关鸟苷酸激酶（membrane-associated guanylate kinase，MA GUK）家族，是第1个被证实的TJs附着蛋白，主要有ZO-1、ZO-2和ZO-3 3个亚型，3个亚型所含区域相同，均有3个PDZ区域，1个SH3区域和1个GUK区域。ZOs家族在胞质内具有多个结合位点，并与Occludin的羧基端及Claudins相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接起来，进而发挥传递信号的作用，形成稳定的连接系统。

1.2.1 ZO-1 ZO-1是构成TJs的主要蛋白之一，沿着细胞膜连续分布，其表达水平的高低与BBB的开放程度相关，其相对分子质量约220～225 kDa，在胞浆内具有许多结合位点，多数位于上皮细胞和内皮细胞的细胞膜相接触的TJs处，少数存在于非上皮细胞黏附连接内层的细胞质中。ZO-1蛋白作为细胞间TJs复合体的重要结构蛋白之一，一方面连接跨膜蛋白，另一方面与TJs细胞内的细胞骨架连接，起到细胞间连接枢纽作用。ZO-1的磷酸化调控是决定BBB血管通透性的至关重要的因素［12］。

1.2.2 ZO-2 ZO-2与ZO-1以复合物的方式定位于TJs的胞浆侧，共同参与组成基因表达和细胞功能的信号传导通路［13］，相对分子质量约为160 kDa，具有一个含有丰富精氨酸的区域，存在于PDZ1和PDZ2之间。ZO-2与ZO-1两者具有较高同源性，尤其在MAGUK保守区域，但是ZO-2仅存在于TJs部位，而ZO-1则广泛分布。

1.2.3 ZO-3 ZO-3相对分子质量约130 kDa，定位于TJs部位，在PDZ1和PDZ2部位富含精氨酸，在PDZ2和PDZ3之间存在一个富含脯氨酸区域。有研究表明，抑制Src活性可以降低Occludin的酪氨酸磷酸化，通过与ZO-1和ZO-3的相互作用提高BBB的通透性［14］。

1.3 细胞骨架蛋白F-actin F-actin蛋白相对分子质量约42 kDa，通过与胞质附着蛋白连接，进而与TJs跨膜蛋白结合，即ZO-1蛋白连接F-actin与Occludin蛋白及Claudins-5蛋白，是TJs复合体不可缺少的部分，是TJs形成胞旁屏障的重要因素之一，对于维持TJs的稳定性具有重要作用。有研究表明冰片能够通过下调ZO-1和F-actin表达水平，选择性的开放血肿瘤屏障，增加其通透性［15］。另有研究表明，氧化应激能导致F-actin重新聚合形成张力丝，从而增强BBB的通透性［16］。

上述紧密连接相关蛋白之间彼此存在复杂联系，不仅作用于TJs，维持其完整性，还为脑内皮组织提供结构支持，如果这些蛋白发生表达紊乱将直接影响TJs的完整性，从而改变BBB的功能。

2 紧密连接相关蛋白的功能

TJs构成了离子与分子通过细胞旁途径跨膜转运的屏障，是保持BBB完整性的重要因素之一，功能主要为屏障作用与栅栏作用，即形成极窄的细胞间粘连，以遮挡细胞外空间和创建可调的分子选择性筛孔。紧密连接相关蛋白在其作用功能中发挥至关重要的作用。

2.1 屏障功能 上皮细胞和（或）内皮细胞屏障的关键成分就是细胞间的连接点，即TJs，其通透性与不同物质的大小、脂溶性及离子所带电荷有关。BBB细胞排列紧密，常用跨膜电阻（transepithelial electrical resistance，TER）作为衡量其通透性的敏感指标，还能用来比较和监视屏障细胞层的形成和调控［17-18］。TJs链是阻塞细胞外空间的基本结构单位，TJs平行链的数目与TER之间也存在着密不可分的联系。

2.2 栅栏功能 Occludin蛋白和Claudins蛋白像栅栏一样镶嵌在脂膜上，在脂膜的顶膜和底侧膜区域形成边界，限制该区域的脂质和蛋白的横向移动，调节细胞旁途径的通透性［19］。TJs没有完全的密封，具有选择透过性，在细胞外的连接部分包含着一定数量的离子选择性孔，发挥选择性运输功能。

3 TJs的调节

3.1 渗透压对TJs的调节 甘露醇是临床上常用的渗透性利尿剂和脱水剂，可以有效地降低颅内压，其作用机制是增加渗透压，使BMECs暂时脱水，构成BBB的细胞体积缩小，间距增宽，其结果是TJs开放，BBB通透性升高。有临床研究表明，应用25%的甘露醇，利用其高渗作用，促进干细胞通过BBB，进而治疗慢性脑卒中［20］。

3.2 PKA对TJs的调节 有研究胰高血糖素样肽-1（GLP-1）对BBB体外模型的作用发现：GLP-1能够增加Occludin和Claudin-5的含量，屏障作用增强；而应用GLP-1受体阻断剂exendin-3（9-39）和PKA阻断剂H89时，屏障作用显著降低，提示GLP-1可能通过cAMP/PKA信号传导，上调紧密连接相关蛋白，稳定BBB的完整性［21］。

3.3 PKC对紧密连接相关蛋白的表达及屏障功能的调节 蛋白质的功能可以通过结构域的不同修饰产生特异性的变化，磷酸化修饰是其中重要的一种形式，主要集中在肽链中的丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸残基上，可使上述残基上不带电荷游离的羟基带电荷，引起结构改变，调节蛋白质的活性和功能。PKC是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，研究表明PKC参与ZO-1、Occludin和Claudin-5的磷酸化修饰，诱导其由细胞膜上向细胞质内重新分布，调节TJs的通透性［22］。

3.4 RhoA-ROCK对TJs的调节 Rho蛋白属于小G蛋白超家族的亚家族成员，有RhoA、RhoB、RhoC三种异构体。ROCK即Rho激酶，属于丝/苏氨酸激酶的一种，有ROCK1和ROCK2两个亚型，其中ROCK1主要参与机体的免疫调节，ROCK2则参与调节内皮和血管平滑肌的功能。研究发现，人类免疫缺陷病毒-1型反式转录激活因子（HIV-1 Tat）可使Occludin蛋白和mRNA表达下调，导致BBB破坏，而阻断Rho/ROCK信号传导通路可抑制HIV-1 Tat诱导BBB破坏作用［23］。膜联蛋白A1可以通过抑制RhoA-ROCK信号通路，修复Aβ1-42诱导的BBB破坏［24］。可见，RhoAROCK信号通路的激活，能够引起TJs蛋白磷酸化反应，使TJ开放，破坏BBB的完整性。

4 问题与展望

TJs作为维持体内BBB完整性的重要结构和功能基础，在应用药物后，紧密连接相关蛋白含量的下降、紧密连接通道的开放对于中枢神经系统疾病的治愈具有重要作用，但目前尚未发现能够有效应用于临床治疗的此类药物。虽然在紧密连接相关蛋白调节开放BBB的过程中还存在许多未知，但相信在未来，通过人们的不断实验和探索，紧密连接相关蛋白影响BBB的研究能够进一步完善。

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（文敏编辑）

Research Progress of Roles of Tight Junction Proteins Involved in the Permeability of Blood-Brain Barrier

ZHANG Nan1，WANG Sidi2，TU Panchun3，YUE Yingfang4，YANG Zhihang5*

（1.Grade 2013，Class 7，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Grade 2013，Class 2；3.Grade 2012，Class 2；4.Grade 2013，Class 6；5.Department of Physiology）

As one of the important organization structure，the blood-brain barrier（BBB）is essential for maintaining brain homeostasis.Tight junctions form the basis structure of BBB to limiting paracellular permeability.This review summerizes the constituentsoftightjunction proteins and its role in the regulation oftightjunction.

tight junctions；blood⁃brain barrier；tight junction proteins

R338.25

A

1008-2344（2017）01-0072-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.01.023

2016-08-01

辽宁省科技厅自然科学基金项目（No.2015020370）；辽宁省大学生创新创业训练计划项目（No.乙类1163）；沈阳医学院科技基金项目（No.20131001）

杨智航（1976—），男（汉），博士，副教授.研究方向：选择性开放血脑屏障的病理机制.E-mail：18940209532@163.com