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大鼠局灶性脑缺血模型神经功能缺损行为学评价工具的研究进展

2017-04-04俞璐曹晓华夏明

神经损伤与功能重建 2017年6期
关键词:横木迷宫脑缺血

俞璐,曹晓华,夏明

·综述·

大鼠局灶性脑缺血模型神经功能缺损行为学评价工具的研究进展

俞璐1,曹晓华2,夏明1

缺血性脑卒中是威胁人类健康的重大疾病,在大鼠脑缺血及脑缺血-再灌注损伤模型的实验研究中,行为学评价是判定脑缺血严重程度、神经功能及学习记忆功能缺损的重要指标。本文对大鼠脑缺血后神经功能缺损行为学评价方法及各自特点做一综述。

脑缺血;大鼠;行为学评价

目前在世界范围内,脑血管疾病已经成为威胁人类健康的重要疾病,其中急性缺血性卒中约80%以上,具有高发病率、高致残率、高致死率和高复发率的特点[1]。动物脑缺血模型可以模拟人类相应的脑缺血疾病,较常用的大鼠脑缺血模型制备方法包括:四血管阻断法、双血管阻断法、三血管阻断法、线栓阻塞大脑中动脉法等[2]。其中,线栓法制备的可逆性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlution,MCAO)模型创伤小、缺血部位固定,可控性好,动物存活时间长,是目前国内外最常用、也是较为理想的局灶性脑缺血模型[3]。MCAO引起损伤的脑区主要包括手术侧的额顶颞叶皮质、豆状核、丘脑及内囊,造模成功后因脑内血液供应障碍导致相应脑区缺血缺氧,从而出现肢体功能障碍、认知损害及情感改变等一系列症状,测试模型动物症状及体征可评估缺血损伤程度、功能恢复情况及模型稳定情况。近年来,越来越多行为学测试被应用于大鼠缺血模型,与各项指标检测结合,实现较为全面系统的脑缺血评价体系。现对目前较常用的大鼠脑缺血后行为学评价方法综述如下。

1 感觉运动功能评价

评价感觉运动功能的常用方法包括神经症状评分、走横木实验、转棒实验、旷场实验、圆筒实验等,与感觉运动功能相关的脑区包括皮质、纹状体等,通过该类实验能够评估动物感觉运动功能,从而判断大鼠脑缺血后的损伤程度。

1.1 神经功能评分

Bederson评分是目前国内外引用频率最高的神经功能评分标准[4],共分为4个功能等级,0分:无神经损伤症状;1分:悬尾试验不能完全伸展对侧前爪;2分:前肢抵抗对侧推力能力下降;3分:向对侧转圈。随着该项评分的应用成熟,有学者对Bederson评分进行改良。如Menzies评分总分为4分:0分:无神经功能损伤,双前肢对称向地面伸展;1分:对侧前肢持续内收;2分:对侧前肢握力下降;3分:轻微刺激大鼠尾巴,向对侧转圈;4分:自主持续转圈[5]。Belayev评分法综合姿势反射实验和前肢放置实验,建立了评分标准[6]。Garcia JH等[7]详细评价了大鼠的运动和感觉功能,建立了18分评分标准,分数最低3分为损伤最严重。Clark评分分别从一般功能损伤和局灶性功能损伤两个角度进行了评分设计[8]。神经症状评分法直观、简便,无需借助其他特殊仪器设备,便可从整体角度观察受试动物神经损伤程度,在行为学测试中应用广泛。但相对其他测试方法,此法主观、粗糙,只能做粗略观察和估计,无法准确描述神经损伤及恢复情况,故在应用时常常联合其他实验评估缺血动物模型的感觉运动功能而不作单独使用。

1.2 走横木实验

走横木实验(beam walking test)根据动物在窄木条上运动能否保持平衡、观察前后肢使用情况和失脚跌落次数进行评分,此法能够评价动物缺血造模后的运动功能、肢体肌力、平衡功能及身体协调性。目前以Feeney等[9]的评分方法最为常用。此法取一横木长120 cm,宽2.5cm,一端为强光及声音噪声,另一端为黑盒,评分等级为1~7分。7分:能够顺利爬行横木,瘫痪肢体完全起作用,无明显神经体征;6分:能够爬过横木,瘫痪肢体起作用>50%;5分:能够爬过横木,瘫痪肢体起作用<50%;4分:不能顺利爬过横木,跌倒几率<50%;3分:不能顺利爬过横木,跌倒几率>50%;2分:在横木上不能行走,但可以坐在上面;1分:完全不能够爬过横木且无法将后肢放在水平位置,放在横木上会掉下去。国内王媛等[10]在用MCAO模型大鼠进行走横木实验时,发现其评分在与大鼠是否充分训练有很大关系。因为个体差异,大鼠在MCAO手术后无法在横木上行走不是因为肢体障碍,而是由于前期训练不充分,加之造模时损伤造成的恐惧因素导致。所以应加强大鼠术前的适应性训练,使其能够顺利通过横木,以确保术后实验评分的准确性和客观性。Hatinen等[11]提出,有时评分显示大鼠运动功能已恢复,但实际感觉、运动损伤仍然存在,评分结果是由于多次训练后大鼠形成习惯,故而该项实验仍需要结合其他测试,才能全面评估大鼠的感觉运动功能。

1.3 转棒实验

转棒实验(rota-rod test)最早由Dunham和Miya建立[12]。实验最先用于大鼠,后被改良后也可用于小鼠,在脑缺血研究中广泛用于评估动物的运动技能和整合性。先将大鼠进行适应性训练,在正式实验中,待动物在恒定速度转动的转棒上保持平衡后,逐渐加快转棒速度,直到大鼠从转棒上掉落,大鼠在转棒上停留的时间可以作为衡量其运动能力的指标。Soman等[13]认为大鼠在转棒上的运动表现受到如运动协调性、学习能力及肌肉耐力等因素影响。Abhilasha等[14]将转棒实验作为评估缺血再灌注损伤后精神运动障碍行为学方面的敏感指标,结果显示缺血后大鼠在转棒上停留时间明显减少,与国内外文献报道一致。

1.4 旷场实验

旷场试验(open field test)通过记录大鼠在新环境中某些行为的发生频率和持续时间,以及动物尿便次数评价大鼠在新环境中自主行为、探索行为与紧张度。实验装置由旷场反应箱和数据自动采集及处理系统两部分组成,操作简便,具有无创、灵敏、客观等优点,被广泛应用。Shu-Jen Change等[15]将姿势反射实验和旷场实验结合,评估动物的感觉运动功能,两项实验共分为5个等级,分别为0分:正常;1分:大鼠前肢和身体向受损大脑对侧持续弯曲;2分:大鼠可以向两侧移动,当尾部被抓起,它只能向受损大脑对侧转圈;3分:大鼠只能向受损大脑对侧转圈;4分:大鼠步行困难或者无法步行。实验结果提示,在MCAO术后第1天,大鼠在旷场实验中能够向受损大脑对侧打圈移动。术后7 d大鼠不再保持向受损大脑对侧转圈,术后14 d大鼠无异于正常鼠。该实验不但可以评价大鼠感觉运动功能,还能通过计算动物排便颗粒判断大鼠的焦虑状态[16]。在实验过程中,值得注意的是,动物在24 h内有活动周期,故每次实验应在同一时间段内完成;保持实验室隔音、光强度温和,湿度温度适宜;2次实验之间要清理实验设备,以免影响下次实验结果。

1.5 圆筒实验

圆筒实验(cylinder test)主要针对不对称中枢神经系统疾病,如帕金森病、阿尔茨海默病、脑卒中等,研究大鼠在贴壁站立过程中前肢的对称性和使用率[17]。实验将大鼠置于一个透明的树脂玻璃圆筒中3~10 min,摄像记录其活动情况。圆筒的形状能够刺激大鼠用前肢垂直探索筒壁,记录3 min内大鼠后肢站立时前肢最初承重触及筒壁的次数,并分别记录左、右侧触及和双侧触及的次数。相关文献报道,大鼠在局灶性脑缺血后,在圆筒实验中前肢的使用情况具有不对称性,且在前肢垂直探索筒壁的过程中,更倾向于使用正常前肢[18]。

2 学习记忆功能评价

评价学习记忆功能的常用方法主要包括各类迷宫实验、主、被动回避实验和跳台实验等,其中迷宫实验通过测试大鼠工作记忆、线索记忆及复杂记忆功能评估大脑缺血后以海马为主的相关脑区受损情况。

2.1 水迷宫实验

Morris水迷宫(Morris water maze test)自上世纪八十年代英国心理学家Richard Morris首次使用以来,成为评估大鼠空间学习和空间记忆功能的经典实验[19],后陆续有研究者将实验改良并用于小鼠。实验将测试大鼠放在一个盛着不透明的圆形水池中,利用大鼠天生游泳健将,却厌恶水中状态的特性,强迫其游泳,学习并寻找隐藏在水下的逃生平台。根据大鼠找到平台所需时间、所经路线长度及游过平台次数等指标评估大鼠对空间位置觉和方向觉的学习记忆能力。经典的测试程序包括两个部分,即定位航行实验和空间探索实验[20]。国内有学者对实验鼠Morris水迷宫成绩的影响因素进行探讨,认为水温、训练时间安排、实验程序安排及鼠的主观因素都可影响水迷宫成绩[21[22],同时在水迷宫实验中脑缺血导致认知缺损所表现出的运动损伤包括:肢体乏力、趋触性游泳(不断沿着水池壁游泳)、转圈姿势增多等[23]。

2.2 旋臂迷宫实验

旋臂迷宫实验(radial arm maze test)最早是由Olton及其同事设计的,利用房间内提供的空间提示信息,促使实验动物找到放置食物的臂所在的部位,是一项由食物奖励驱使的任务,同样用于评估动物学习记忆功能,该实验对海马损伤尤为敏感[24]。正常的动物通常会利用一切策略来完成任务,如依靠嗅觉寻找食物气味来判断其位置,或者在离开一个臂进入另外一个臂时总是向右转,从而更快速寻找到食物位置等。但目前旋臂迷宫较少用于评估脑缺血动物模型认知功能,因为大鼠在脑缺血手术后体重明显下降,无法像假手术组动物那样积极寻找食物[25],并且食物的气味可能会影响实验结果客观性[26]。

2.3 Barnes迷宫实验

Barnes迷宫实验(Barnes maze test)自1976年发明以来,主要测量动物对一个目标的空间记忆能力,针对动物脑缺血后运功功能受损在Morris水迷宫实验中可能出现的假阳性结果,Barnes迷宫的实验设计中无需足底电击、食物夺取等,对动物的刺激更少,体能消耗要求更低。目前Barnes迷宫在高度紧张大鼠[27]、代谢综合征大鼠[28]、全脑缺血认知功能损害大鼠[29]、帕金森病大鼠[30]等模型中均有广泛应用。但这些疾病本身便可引起不同程度的情感精神异常,因此Barnes迷宫评价空间记忆功能同样可受到情感行为因素的影响,故而在大鼠局部脑缺血模型中Barnes迷宫的应用仍有受限。

2.4 主动/被动回避实验

主动/被动回避实验(Active/passive avoidance test)是利用大鼠的好暗避光和对厌恶刺激的恐惧记忆建立起来的。实验可根据设备不同分为穿梭回避实验、跳台回避实验等[31],但实验目的基本相同,即测试大鼠脑缺血后认知相关行为方式的改变。实验将大鼠放入一个分割为明暗两箱的大箱中,当大鼠被放入明箱后通常会在数秒内进入暗箱,待大鼠进入暗箱后,关闭中门,并给予其一次引起退缩和发声的最小电刺激,并让大鼠在暗箱中停留10 s(训练阶段),在电刺激训练后24 h后进行记忆保持测试,将大鼠放回暗箱,但不给予电击,大鼠进入明箱的潜伏期缩短(主动回避实验)或进入暗箱的潜伏期延长(被动回避实验)即获得了学习记忆功能的保持。由于被动回避的假阳性率较主动回避的假阴性率高,所以目前对于认知功能的测试多采用被动回避实验。国外学者的研究表明,大鼠双侧颈总动脉永久性结扎后由于永久性脑缺血,在被动回避实验中逃避反应明显下降,相较于假手术组表现出持续性的学习记忆功能损害[32]。

2.5 跳台实验

跳台实验(step-down test)是利用大鼠喜好在空间边缘和角落活动的习性,测试大鼠脑缺血后短时记忆功能缺损情况。实验装置是一个20×20×60 cm的暗箱,箱底铺垫铜栅,通36 V交流电,将大鼠放置在暗箱中间高起的平台上,大鼠跳至铜栅上就会受到电击,正常反应是跳回平台躲避电刺激[33],记录3 min内大鼠第1次跳下平台的潜伏时间及跳下平台次数作为记忆保留的评价指标[34]。此实验受研究者主观影响较小,但实验过程中需要受到电刺激,一般同一批鼠不与被动回避实验同时测试。

2.6 物体识别实验

物体识别实验(object recognition test)是利用动物先天对新物体具有探索倾向的原理,由Ennaceur和Delacour于1988年报道的一种用于检测大鼠识别记忆的行为学测试方法[35]。实验分为3个阶段,分别是适应期、熟悉期和测试期[36]。适应期时将大鼠放入没有任何物体的实验装置中,使其适应探索环境;熟悉期时在实验装置中放入2个完全相同的物体,将大鼠背对物体放入实验装置中,一定时间后再将大鼠取出;测试期时将2个相同物体中的一个换成另一个不同物体,让大鼠再次进行探索。在测试时,为防止大鼠对某个物体或某个位置特别偏爱出现误差现象,对大鼠依次进行实验时的位置要互相交换。物体识别实验中最基本的指标是熟悉期对物体的探索时间及测试期分别对熟悉物体和新物体的探索时间。有研究报道表明,物体识别实验对时间间隔很敏感,即经过较长时间间隔后(如24 h),动物将无法区分新旧物体[37]。相对于其他记忆任务,物体识别实验具有许多优势,包括[38]:周期较短,消耗体力较小,避免长时间训练对动物造成的影响;进入结果分析的数据较全面;更加接近模拟人类的学习记忆行为,是一种精细、敏感的行为学检测方法,常被用于研究脑功能区的分子机制及脑组织损伤研究[39,40]。

3 焦虑水平评价

啮齿类动物在脑缺血后会出现不同程度焦虑,并影响其行为学表现,近年来越来越多焦虑样行为学测试用于脑缺血损伤实验研究中[41,42],包括高架十字迷宫、明暗穿箱实验等。

3.1 高架十字迷宫实验

高架十字迷宫实验(elevated plus maze test)是目前应用最广泛,最有效的焦虑样行为评价方式,其根据啮齿类动物偏好探索开臂,但又因恐惧开臂高悬敞开的环境而致焦虑水平上升,故选择黑暗封闭的闭臂进行探索而建立。实验装置由2个开臂(50×10 cm)和2个相同尺寸四面包墙的暗臂组成,开臂和暗臂距离地面50 cm,实验以开臂进入次数比和开臂停留时间比为经典指标,可反映动物趋近、规避冲突的结果,与焦虑程度直接相关[43]。国外研究表明,脑缺血后焦虑水平的改善表现在动物对开臂的探索,其进入开臂的次数和停留时间比上升[44]。

3.2 明暗穿箱实验

明暗穿箱实验(light-dark exploration test)最早由Crawley JN于1980年提出,作为评价抗焦虑药物的药理效应,主要通过穿梭次数评价啮齿类动物的焦虑情绪[45]。实验装置由两个聚乙烯材质箱子(20×20×14 cm)和一个连接通道(5×7×10 cm)组成,一个箱子内壁涂成黑色,另一个箱子以灯照亮,将动物放置在明箱里,计算10 min内动物在暗箱内的时间和两箱之间的穿梭 次[46]。国外研究报道,大鼠在脑缺血后呈焦虑状态,其在暗箱停留的时间显著增加,予安定类药物后可降低其焦虑水平[46]。

4 总结与展望

功能性测试对评价脑卒中疗效非常重要,近数十年来,建立了多种有效的大鼠脑缺血后行为学评价方法,包括感觉、运动、学习、记忆功能以及焦虑水平的评价。相对于小鼠,大鼠体形较大,适应好,缺血手术后机体恢复能力强,智力水平更高,故而在大鼠脑缺血领域,行为学测试研究应用广泛。如上所述,每种测试方法各有侧重和特点,有的偏向于评估肢体功能,有的偏向于测试空间记忆,有的需要反复训练,有的则易受到主观影响,目前尚未有单一评价标准被普遍认同,故而仍应根据实验目的合理选用各类行为学测试,将其有效结合,能够更好规避单项实验偏差,全面评估大鼠脑缺血后的功能、感觉、认知及情绪改变。

大鼠局灶性脑缺血模型的行为学测试目前依然面临一些共性问题,包括:脑缺血成功后2~3周的大鼠肢体运动与认知功能的自愈性与临床中的实际情况不完全符合;局灶性脑缺血模型制备后缺血程度的不一致使大鼠生存时间不统一,对于有些训练周期较长、消耗体力较大的行为学测试,其脱落率较高;在测试过程中我们仍需注意大鼠气味、室内光线和温度对实验的影响,并针对不同品系大鼠、卒中后不同时间窗,根据脑卒中类型选择敏感度高、更为合理的行为学测试。将行为学评价工具不断改良优化的同时,与其他研究技术结合,从整体层面、分子层面、基因水平等各方面实现研究目的,在脑缺血及学习记忆领域,以期更好的将基础实验服务于临床。

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R741;R741.02;R743

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.06.020

1.上海中医药大学附属普陀医院中医内科上海200062 2.华东师范大学脑功能基因组学教育部及上海市重点实验室上海200062

国家自然科学基金(No.81503370)上海市卫计委青年医师培养计划资助项目

2017-03-16

俞璐laurieyu@sohu.com

(本文编辑:唐颖馨)

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