不同浓度TGF-β1对人髓核细胞外基质成分基因表达的调控作用比较＊

张荣峰，孙新君，张超，阮狄克

基础医学

不同浓度TGF-β1对人髓核细胞外基质成分基因表达的调控作用比较＊

张荣峰，孙新君，张超，阮狄克

目的研究在体外培养条件下，不同浓度转化生长因子-β1（TGF-β1）对人髓核细胞聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型胶原及SOX-9基因表达的调控作用。方法以传2代人髓核细胞为研究对象，分别以0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L、100μg/L四种浓度的TGF-β1为培养液，设不含生长因子培养液为对照组，应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX-9 mRNA表达情况。结果0.1μg/L TGF-β1组与对照组相比，无显著性差异。1μg/L、10μg/L和100μg/L TGF-β1组在促进Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX-9基因表达方面作用显著，差异均具统计学意义。其中，10μg/L组促进细胞mRNA表达作用最明显。结论TGF-β1能够促进髓核细胞Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX-9基因的表达，提示TGF-β1有可能在椎间盘退行性疾患的预防和治疗中发挥重要作用。

转化生长因子-β1；髓核细胞；基因表达；聚集蛋白聚糖；Ⅱ型胶原；SOX-9基因

椎间盘退变引起的颈肩痛、腰腿痛十分常见，当前的治疗方法虽然能够解除疼痛，但不能修复退变的椎间盘。只有通过细胞学的方法维持细胞外的正常基质成分，从而重建椎间盘的高度和生物学性能，才能从根本上阻止或延缓椎间盘退变；髓核细胞作为分泌髓核内基质的主要载体，其在正常髓核组织内数目较少，在体外培养条件下容易发生去分化，丧失正常的细胞表型，这就限制了髓核细胞生物学治疗的应用［1］。通过生长因子的方法，刺激髓核细胞合成细胞外基质，为逆转椎间盘退变带来了新思维［2］。本实验通过研究不同浓度TGF-β1对人正常髓核细胞Aggrecan和Ⅱ型胶原基因、SOX-9基因表达的调控作用，来探索早期阻止或逆转椎间盘退变的有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和髓核组织来源HAM’S/F12培养液、胎牛血清、胰蛋白酶（HyClone公司，美国），Ⅱ型胶原酶（Gibco公司，美国），MTT、DMSO（Sigma公司，美国），培养瓶、培养板（Corning公司，美国），rh-TGF（Peprotech公司，美国），引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，Trizol reagent试剂（Gibco公司，美国），反转录试剂盒（日本Takara公司）。人髓核组织取自青少年脊柱侧弯矫形手术患者。

1.2 细胞分离与培养取得髓核组织后，立即在超净工作台内筛选实验用的髓核组织，去除纤维环及交界区组织，用PBS冲洗后剪成碎组织块，用0.25%的胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min摇动一次，800～1000 rpm离心5min，去上清液，用0.2%的胶原酶于37℃下消化4 h，120目尼龙网筛过滤，细胞悬液1000 rpm离心5min，弃去上清液，D-Hanks液悬浮细胞，1000 rpm，离心5min，进行酶液清洗，共三次。清洗后的细胞，用F12-10%FBS（胎牛血清）2m l稀释，台盼兰染色，计数板进行细胞计数。以2×104细胞/cm2接种在75 cm2培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱中培养。隔2～3 d换液、细胞生长达80%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3 总RNA提取和RT-PCR取处于对数生长期的传2代人髓核细胞，达80%融合后，1000 rpm离心后，去上清，用含10%FBS的F12培养液调整细胞浓度为1×104/m l，按1∶5接种于5个75 cm2培养瓶，24 h后，吸出培养基，分别加入由10%FBS/ F12配制成的0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L、100μg/L四种浓度的TGF-β1，对照组不加生长因子。培养瓶内的各组细胞培养72 h，按照Gibco公司Trizol一步法说明，提取各组细胞的总RNA，紫外分光光度仪测纯度与浓度。取2μg总RNA，按照逆转录试剂盒说明，用AMV反转录酶进行反转录，反转录后获得的cDNA通过Real-Time PCR对蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX-9进行扩增。以管家基因磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参。引物序列根据文献报道合成［3］：GAPDH上游：5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3'，下游5'-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3'；PCR的反应条件均为：94℃30 s，52℃45 s，72℃45 s，30个循环。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳图片用IBAS2.5图像处理系统分析，以Aggrecan和Ⅱ型胶原吸光度与GAPDH吸光度的比值作为其相对表达量。

以上实验重复3次。

1.4 统计学分析用SPSS 15.0软件中的One-Way ANOVA法，对实验测得的吸光度值数据进行统计学分析，检测结果以x±s表示，比较试验组和对照组间的吸光度值差异，结果进行t检验，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

10%血清条件下，在Aggrecan表达方面，对照组的吸光度比值为0.775±0.024，TGF-β1 0.1μg/L组的吸光度比值为0.828±0.008，与对照组相比，无显著性差异，1μg/L、10μg/L、100μg/L组的吸光度比值分别为1.361±0.016、1.814±0.029、1.163±0.027，与对照组相比，差异具有统计学意义。在促进Ⅱ型胶原基因表达方面，与对照组的吸光度比值1.312± 0.036相比，TGF-β1 0.1μg/L组无显著性差异（P> 0.05），1μg/L、10μg/L、100μg/L组差异均具统计学意义，其中，10μg/L组促进细胞表型基因mRNA表达作用最明显。在促进SOX-9基因表达方面，与对照组相比，0.1μg/L组无显著性差异（P>0.05），1μg/ L差异有统计学意义（P<0.05）、10μg/L、100μg/L组差异非常显著（P<0.01）。

3 讨论

椎间盘退变是一种发病率及致残率极高的疾病，常引起以颈腰腿痛，其中髓核组织在椎间盘退变过程中起首要的作用［4］。正常髓核组织呈胶冻状，主要是软骨特异性基质成分蛋白聚糖和Ⅱ型胶原组成，与软骨组织相比，髓核组织中蛋白多糖的含量相对较高，比较髓核内和软骨内蛋白多糖与Ⅱ型胶原的比例，髓核组织约为27∶1，而软骨组织只有2∶1［5］。蛋白多糖被包埋在由Ⅱ型胶原组成的网格中，其中Aggrecan是蛋白多糖的主要成分，吸附水分的能力特别强大，因此，正常髓核组织含水量非常丰富，可达80%，具有屈曲性和黏弹特性，能够承受压力、吸收震荡［6］。髓核组织为无血管组织，营养的供给主要通过组织间的弥散和渗透，长期承受压应力、剪切力，极易发生退变。退变后Aggrecan和Ⅱ型胶原逐渐减少，Ⅰ型胶原增多，促使髓核结构逐渐纤维化，丧失承受压力的能力，并导致纤维环、软骨终板的退变。

目前治疗椎间盘退变性疾病的方法包括保守治疗和手术治疗，这些措施虽能缓解症状，并不能解决椎间盘本身的退变问题，其远期疗效并不理想［7］。随着组织工程及再生医学的发展，以细胞为基础的生物学治疗修复退变的椎间盘逐渐成为国内外学者的方向［8，9］，而利用细胞因子的作用，提高髓核细胞的活性，促进正常细胞外基质的合成，为延缓或逆转椎间盘退变的进程提供了可能。TGF-β1是一种分子量为25 kd的双链多肽，具有促进细胞增殖，调节细胞分化，促进细胞外基质合成功能［10］。本课题组之前的研究提示，在10%血清条件下，TGF-β1能提高细胞的增殖活性，并且在1~10μg/L的浓度范围内呈剂量效应关系［11］。

由于髓核细胞缺乏特异性细胞标志，国内外研究中通常选用蛋白多糖、Ⅱ型胶原和SOX-9作为髓核细胞的特异性标记。SOX-9基因是促进软骨细胞分化和维持软骨细胞表型的调控基因，与椎间盘退变密切相关，它能增加椎间盘基质中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，延缓椎间盘退变的发展［12］。本研究结果提示，TGF-β1在1～100μg/L浓度时对可以显著促进Aggrecan和Ⅱ型胶原基因、SOX-9基因的表达，说明在体外培养条件下，TGF-β1对人髓核细胞的表型表达具有重要的促进和维持作用，特别是在浓度10μg/L时调控作用最显著。这就使体外培养髓核细胞作为组织工程椎间盘的种子细胞成为可能。

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［2016－07－13收稿，2016－08－11修回］［本文编辑：宋敏］

Com parative study on the regulation effects of TGF-β1 at d ifferent concentration in vitro on cellular aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of hum an nucleus pulposus

ZHANG Rong-feng①，SUN Xin-jun，ZHANG Chao，et al.①Department of Orthopedics，the 89th Hospital of People's Liberation Army，Weifang，Shandong 261000，China

Objective To investigate the regulation effects of TGF-β1 on aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of human nucleus pulposus at different concentration in vitro.Methods Passage 2 nucleus pulposus cells were cultured in the medium with 10%FBS and at different concentrations（TGF-β1 as 0.1μg/L，1.0μg/L，10μg/L，100μg/L）.The medium without TGF-β1 was taken as control group.The mRNA expression of aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene was assayed by RT-PCR.Results The 0.1μg/L TGF-β1 group hadn't significant difference compared with the control group.The 1μg/L，10μg/L and 100μg/L groups，promoted mRNA expression of aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene compared with the control group，the difference had statistical significance.Conclusion TGF-β1 is efficient to promote aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of human nucleus pulposus which might be a future therapeutic potential in the treatment of intervertebral disc degeneration.

Transforming growth factor-β1；Nucleus pulposus cells；Gene expression；Aggrecan；CollagenⅡ；SOX-9 gene

R681.5+3

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.017

国家自然科学基金项目（30370389）

261000山东潍坊，解放军89医院骨科（张荣峰，孙新君）；100037北京，海军总医院骨科（张超，阮狄克）