miR-96的表达对肝细胞癌细胞迁移和侵袭的影响

赵新阳，肖朝文，郑小林，蔡常春

（华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 肝胆胰外科，湖北 武汉 430014）

在全球范围内，肝细胞癌（HCC）是种常见的恶性肿瘤，发病率男多于女，据2012年数据统计，有约782500新诊断HCC病例，745500例HCC死亡病例[1]。HCC尤以东亚、东南亚、北非和西非高发，仅中国就占了一半病例。HBV、HCV和黄曲霉毒素都是HCC的常见致病因素。得益于HCC综合治疗的进步，5年生存率已由12%～20%上升至35%～50%。但转移与复发仍是影响HCC预后的主要因素。深入研究HCC的迁移和侵袭机制，对提高HCC诊治水平有重要的意义。小分子核糖核酸（miRNA）是一类非编码RNA，长度约19～22 nt[2]，其通过在转录后水平与mRNA结合而靶向下调靶基因的表达[3]，广泛参与增殖、凋亡、侵袭、转移等肿瘤生物学过程[4]。miR-96定位于染色体7q32.2[5]，在乳腺癌[6]、非小细胞肺癌[7]、肾细胞癌[8]、甲状腺癌[9]、膀胱癌[10]等肿瘤中的作用已见报道，但miR-96对HCC细胞迁移和侵袭的影响，尚未见报道，本研究在体外探讨miR-96对HCC细胞迁移和侵袭的影响，及其可能的机制。

1　材料与方法

1.1　材料

人HCC细胞系HepG2、7721、huh7及正常肝组织细胞系L02购自中国医学科学院，RPMI-1640培养基、胎牛血清及胰蛋白酶购自美国Hyclone公司，TriZol购自美国BD公司，实验所需一抗购自美国BD公司，二抗购自美国Invitrogen公司，miR-96模拟物（miR-96 mimics）及抑制物（miR-96 inhibit）均由广州锐博生物科技公司合成，Lipofectamine 2000 转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。miR-96模拟物序列：5′-UUU GGC ACU AGC ACA UUU UUG C-3′，miR-96抑制物序列：5′-GCA AAA AUG UGC UAG UGC CAA A-3′。

1.2　细胞培养、转染及分组

在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的条件下，将HepG2、7721、huh7及L02细胞系培养于RPMI-1640培养基中，将处于对数生长期的HepG2细胞分成3组，阴性对照组、miR-96模拟物组及miR-96抑制物组，采用Lipofectamine 2000分别转染miRNA随机序列、miR-96模拟物和miR-96抑制物，转染浓度为20 nmol/L，继续培养24 h行细胞划痕和Transwell实验。

1.3　RNA提取和荧光定量PCR（qRT-PCR）检测

1.3.1miR-96相对表达量测定按TRIZol reagent说明书，从培养细胞中提取总RNA，然后按照TaqMan RNA reverse transcription kit（ABI，USA）说明书，从5 ng的总RNA逆转录合成cDNA。在ABI 7500实时定量PCR仪中，以U6小核RNA作为内参，U6序列正义链：5′-GTG CTC GCT TCG GCA GCA CATA T-3′，反义链：5′-AAA AAT ATG GAA CGC TTC ACG AA-3′；miR-96正义链：5′-TGG CCG ATT TTG GCA CTA GC-3′，反义链：5′-TTT CCC ATA TTG GCA CTG-3′。使用 2-ΔΔCt方法定量，计算 miR-96的相对表达量。

1.3.2PTPN9 mRNA相对表达量检测提取细胞总RNA后，用AMV reverse transcriptase反转录为 cDNA，按 95 ℃5 min，随后 95 ℃30 s、55 ℃30 s、 72 ℃30 s，共40个循环。PTPN9正义链：5′-CCT GCC TTA GAC TGG GAC T-3′，反义链：5′-TTC GCT TTG TTA GCT TCA CT-3′；GAPDH正义链：5′-CGA GCC ACA TCG CTC AGA CA-3′，反义链：5′-GTG GTG AAG ACG CCA GTG GA-3′。以 GAPDH 为内参，使用 2−ΔΔCt方法定量，计算公式：ΔΔCT=（CT PTPN9-CT GAPDH）实验组-（CT PTPN9-CT GAPDH）对照组，计算PTPN9 mRNA的相对表达量。

1.4　细胞划痕实验

将阴性对照组、miR-96模拟物组及miR-96抑制物组的HepG2细胞用RPMI-1640（含有10%胎牛血清）培养在六孔板上，待融合后，用Tips枪头划直线，划痕后0～24 h，用反转的Olympus IX50显微镜通过10×物镜和Image-Pro Plus软件捕获测量划痕面积，计算划痕愈合率，划痕愈合率越高，表示迁移能力越强。

1.5　Transwell细胞侵袭实验

阴性对照组、miR-96模拟物组及miR-96抑制物组的HepG2细胞各取2×103个细胞，种在Transwell小室的碳酸磷脂表面，上室BioCoat TM包被Matrigel基质胶，37 ℃培养24 h。取出上层小室，将膜下面的细胞与1%多聚甲醛混合，用0.2%结晶紫溶液染色15 min。在200倍视野下计算穿膜细胞数，随机取10个视野，计算平均值。实验重复3次，取平均值。

1.6　Western blot

培养24 h后消化细胞，取细胞总蛋白，蛋白变性、上样，每泳道上样量为50 μg蛋白。50 V、100 mA电泳2 h结束后，PVDF膜转膜。脱脂奶粉液封闭2 h。TBS清洗，分别加入PTPN9一抗（1:200）、GAPDH一抗（1:200），二抗浓度1:1000，ECL显影。测量条带的灰度值。目的蛋白的相对数值=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.7　统计学处理

采用Graphpad 6.0统计作图软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组均数采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1　miR-96在HCC细胞及正常肝细胞系中的表达

荧光定量PCR结果示，miR-96在HCC细胞系HepG2、huh7、7721细胞系相对表达量分别为7.1±0.63、4.8±0.31、3.9±0.23，均明显高于正常肝细胞系L02的相对表达量（1.1±0.15），差异均有统计学意义（均P＜0.01）（图1）。

图1　miR-96在HCC和正常肝细胞系中的表达Figure 1　The miR-96 expressions in HCC cell lines and normal hepatic cell line

2.2　转染效率检测

转染HepG2细胞24 h后，设阴性对照组为miR-96的表达量1.0，模拟物组miR-96的相对表达量为6.0±0.3，miR-96抑制物组为0.20±0.09，差异均有统计学意义（均P＜0.001）（图2）。

图2　不同转染组HepG2细胞miR-96的表达Figure 2　The miR-96 expressions in different transfection groups of HepG2 cells

2.3　miR-96对HCC细胞迁移与侵袭的影响

细胞划痕实验示，阴性对照组细胞划痕愈合率为（53.47±4.39）%，而miR-96模拟物组细胞划痕愈合率为（74.73±5.63）%，miR-96抑制物组细胞划痕愈合率为（24.38±3.74）%，前者划痕愈合率明显高于阴性对照组，后者划痕愈合率明显低于阴性对照组（P＜0.05）（图3A-B）。

细胞侵袭实验示，200倍视野下，阴性对照组侵袭细胞数为（329±13）个，而miR-96模拟物组侵袭细胞数为（548±18）个，miR-96抑制物组侵袭细胞数为（179±9）个，前者侵袭细胞数明显多于阴性对照组，后者侵袭细胞数明显少于阴性对照组（P＜0.05）（图3C）。

图3　miR-96对HCC细胞迁移与侵袭的影响　A-B：细胞划痕实验结果；C：侵袭实验结果Figure 3　Influences of miR-96 on migration and invasion of HCC cells　A–B: Results of wound scratch assay; C: Results of Transwell assay

2.4　miR-96对HCC细胞PTPN9表达的影响

qRT-PCR结果：设阴性对照组PTPN9 mRNA表达量为1.0，miR-96模拟物组PTPN9 mRNA相对表达量为0.32±0.04，miR-96抑制物组PTPN9 mRNA为5.32±0.13，前者明显降低，后者明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图4A）。

Western blot结果：设阴性对照组PTPN9蛋白表达量为1.0，miR-96模拟物组PTPN9蛋白相对表达量为0.36±0.03，miR-96抑制物组PTPN9蛋白相对表达量为3.42±0.24，前者明显降低，后者明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图4B-C）。

图4　miR-96对HCC细胞PTPN9表达的影响　A：qRT-PCR结果；B-C：Western blot结果Figure 4　Influences of miR-96 on PTPN9 expression in HCC cells　A: Results of qRT-PCR; B–C: Results of Western blot

3　讨　论

HCC是种高度恶性的肿瘤，虽然手术仍是治疗HCC的最有效方法，据日本对148161例大宗HCC切除术后随访报道[11]指出，术后5年生存率由1978—1980年间的5.1%上升到2001—2005年间的42.7%，但肝切术后预后仍较差。转移与复发仍是影响HCC预后的主要因素。肿瘤的发生与进展是个涉及到一系列分子突变或异常表达的结果，比如miRNA[12-15]、P16、P53[16]、转化生长因子β[17]等。

miR-96在肿瘤中所起的作用不尽相同。在甲状腺癌细胞中，外源性过表达miR-96，促进了K1和TPC1细胞系增殖和克隆形成能力，并抑制凋亡；反之，下调miR-96表达，则抑制了K1和TPC1细胞系增殖和克隆形成，并促进凋亡。荧光素酶实验示，miR-96可与FOXO13′-UTR区域靶向结合，并下调FOXO1表达[9]。在乳腺癌细胞系中，miR-96促进细胞增殖、迁移和侵袭，并且miR-96可靶向调节PTPN9蛋白的表达，起癌基因的作用[6]。与之相反，在肾癌中，miR-96起抑癌基因的作用，对高侵袭能力的细胞系Caki-1和低侵袭潜能的细胞系786-O转染miR-96抑制物后，侵袭能力增加，而转染miR-96模拟物后侵袭能力降低[8]。Yu等[18]报道miR-96直接靶向结合K-ras癌基因，抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭，并减慢肿瘤生长速度。Vishuamitra等[19]报道miR-96抑制渐变性淋巴瘤细胞增殖、克隆形成和迁移能力。表明在不同的肿瘤中，miR-96所起的作用可能完全不同。

蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosine phosphatases，PTPs）是细胞发挥生物学功能的关键分子之一，其表达异常常与肿瘤的发生密切相关[20]。PTPN9是PTPs家族中的一员，其通过对ErbB2和信号转导及转录活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）脱磷酸化，进而沉默ErbB和STAT3信号通路而发挥抑癌作用[21-23]。在乳腺癌中，PTPN9在癌组织中低表达，且抑制乳腺癌的增殖和侵袭[6]。

在HCC体外实验中，本研究发现miR-96较正常肝脏细胞系L02高表达，通过向HepG2细胞系转染miR-96模拟物，发现划痕愈合率显著高于阴性对照组，侵袭细胞数显著多于阴性对照组；反之，转染miR-96抑制物后，划痕愈合率显著低于阴性对照组，侵袭细胞数显著少于阴性对照组，表明miR-96促进HCC细胞的迁移和侵袭，其促癌基因的作用，这与甲状腺癌、乳腺癌中的结果一致，而与肾癌、胰腺癌及间变性淋巴瘤[19]中的结果相反。

miR-96分子为PTPN9的上游分子，通过荧光素酶实验，Hong等[6]发现miR-96可靶向结合PTPN9，并下调其表达，进而促进乳腺癌的增殖和侵袭。Hu等[24]在HCC中报道PTPN9在HCC组织中低表达，并且PTPN9下调表达与HCC预后差相关，下调PTPN9表达促进HCC细胞系增殖，并抑制其凋亡。本研究结果与其相似，miR-96模拟物组较阴性对照组PTPN9下调表达，反之，转染miR-96抑制物后，PTPN9上调表达，其促进HCC细胞迁移和侵袭的机制可能与下调PTPN9的表达有关。

当然，本研究也存在一定的不足，比如，miR-96在HCC组织中的表达及HCC细胞的增殖和凋亡的影响如何，在动物实验中结果如何，还需进一步研究和探讨。

综上，本研究发现miR-96在HCC细胞系中高表达，且miR-96上调表达可促进HCC细胞迁移和侵袭，miR-96的上调表达可下调PTPN9的表达，miR-96在HCC发生过程中起促癌基因的作用，有可能成为一个新的治疗靶点。

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