臭豆腐挥发性风味物质的研究进展

,,,,*

(1.德州职业技术学院粮油食品与轻工工程系,山东德州 253034;2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310012; 3.韩德秀平壤轻工业大学,朝鲜平壤 999093)

臭豆腐挥发性风味物质的研究进展

侯娟1,2,谷静思2,金成日3,何国庆2,*

(1.德州职业技术学院粮油食品与轻工工程系,山东德州 253034;2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310012; 3.韩德秀平壤轻工业大学,朝鲜平壤 999093)

挥发性风味物质是臭豆腐的主要风味物质,是臭豆腐重要的质量参数。本文对臭豆腐中挥发性物质的形成过程、风味物质成分的萃取方法、鉴定方法、形成风味物质的影响因素等方面进行了综述,并指出臭豆腐风味物质的研究趋势。

臭豆腐,挥发性风味物质,鉴定方法,研究趋势

臭豆腐是我国的传统发酵制品,根据工艺不同分为非发酵型和发酵型两种。南方臭豆腐属于非发酵型,制作过程一般分为臭卤水制作(一般用苋菜、香菇、浏阳豆豉等发酵获得)、豆腐浸泡、油炸几个阶段[1]。发酵型臭豆腐以北方臭豆腐为代表,是腐乳的一种,有严格的前期发酵过程。臭豆腐经过长时间的发酵,营养价值高,游离氨基酸和锌、铁、钙等矿物质含量丰富[2],对人体的肠道吸收有利。臭豆腐“闻起来臭,吃起来香”,与其挥发性风味成分相关。由于制作工艺和地域的不同,臭豆腐的风味差别较大。挥发性风味物质是臭豆腐重要的质量参数,对产品整体风味起着重要作用。因此,开展臭豆腐中挥发性风味物质的研究对于提高产品质量,改进生产工艺具有重要意义。本文阐述了臭豆腐中挥发性风味物质的形成、提取鉴定方法和风味形成影响因素,并指出臭豆腐风味物质研究方向,以期对臭豆腐风味物质研究提供参考。

1 臭豆腐挥发性物质的形成

不管是发酵型臭豆腐还是非发酵型臭豆腐,生产过程中都离不开微生物的参与。原料中的蛋白质、糖类等在多种微生物及其分泌的酶类的作用下分解,释放出大量的酯类、醇类、含硫类化合物等,形成了臭豆腐的特殊风味[3]。发酵型臭豆腐分为前期培菌和后期发酵两个阶段。前期培菌主要是菌在白坯上繁殖,长出的菌丝体把坯体包裹,代谢产生的酶类又将一部分蛋白质分解成水溶性蛋白质的过程。后期发酵是在前酵分泌的酶类、汤料中的菌类和化学物质的协同作用,将坯体中蛋白质等大分子化合物降解、酯化的过程[4]。有研究发现蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶三种酶的活力因腐乳后发酵过程的不同阶段而不同,中间产物也不同[5]。徐寅等[6]对南京等8个地方采集的臭豆腐样品进行了乳酸菌分离,比较分析总乳酸菌数与成分之间的关系。研究发现乳酸菌数量与臭豆腐总酸、氨基酸态氮含量正相关。亓顺平等[7]发现非发酵型臭豆腐中臭味主要来源于含硫物质的分解。但也有学者认为其特殊的风味可能是化学反应的结果,而不是微生物产生的[8]。

2 臭豆腐挥发性物质的分析方法

臭豆腐的挥发性风味物质组成十分复杂,不同品牌产品的风味物质组成差别较大。因此,风味物质的提取和分析方法至关重要。常用的挥发性物质的提取方法有顶空法(Head Space)、固相微萃取法(SPME)、同时蒸馏一萃取法(SDE)等[9]。李里[10]采用了固相微萃取、溶剂萃取法和同时蒸馏提取法对臭豆腐香气成分的提取,并比较了3种提取效果，结果发现对同一臭豆腐样品,出峰较少是溶剂萃取法和固相微萃取法,得到的组分保留时间也相对靠前;而同时蒸馏提取法的保留时间分布宽,出峰多。马艳莉[11]等比较了顶空固相微萃取法、动态顶空法和同时蒸馏提取法对青方腐乳挥发性风味物质的提取效果。结果表明,同时蒸馏萃取和顶空固相微萃取法提取的风味物质的数量、含量都低于动态顶空法提取的。不同提取方法萃取得到臭豆腐种类和含量都存在差异。其中,固相微萃取中不需要使用有机溶剂,挥发性物质的损失能较为真实地反映样品的成分组成,在食品中挥发性成分提取中应用广泛,但是也有其缺点,如萃取头种类、涂层材料的极性不同,对不同极性的挥发物萃取效果也不同。Liu等[12]比较了在固相微萃取4种萃取头对发酵型臭豆腐挥发性物质萃取效果,结果发现Carboxen/PDMS最适合提取发酵臭豆腐中的有机挥发物。

气相色谱法、气相-嗅闻法、气相色谱一质谱联用法(GC-MS)等是目前常用的风味物质鉴定方法。GC-MS法样品用量少、分析快、分离和鉴定同时进行,同时具备气相色谱的高分辨率与质谱的高灵敏度特点[13],是最常用的使用方法。亓顺平等[7]以非发酵臭豆腐为研究对象,采用同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱联用仪进行分析,共检测出49种挥发性风味化合物。含量高的是醛类、醇类、酯类、酸类几种化合物。以化合物的香气活性值来看,非发酵臭豆腐中主要的挥发性成分是二甲基二硫、(E,E)-2,4-癸二烯醛、3-甲基丁醛、壬醛、丁酸乙酯、4-甲基苯酚、1-辛烯-3-醇。非发酵臭豆腐的特色风味是卷心菜味、果味、脂肪味、泥土味等。贺静等[23]分析了四个不同发酵阶段的臭豆腐卤水,共鉴定出包含醇类、酸类、酯类等122种挥发性风味成分。化合物种类随着发酵的进行而变化,其中3-甲基吲哚贯穿整个发酵过程。

马艳莉等[14]采用动态顶空萃取法,气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术鉴定出青方腐乳中73种挥发性风味物质。结合嗅闻技术,其中25 种物质被确定为关键挥发性风味物质。对青方腐乳风味贡献最大的是苯酚、三甲基肼、吲哚、二甲基二硫醚、乙酸乙酯、二甲基三硫醚、丁酸。刘玉平等[15]以北京王致和臭豆腐为研究对象,采用SPME结合GC-MS方法,共鉴定出挥发性成分31种。其中,乙酸丁酯、吲哚、二甲基三硫醚、丁酸乙酯、二甲基四硫醚、丁酸丙酯、二甲基二硫醚、1-丁醇、苯酚、丁酸、1-己醛含量较高。而孙洁雯[16]等采用同时蒸馏萃取法进行挥发性成分提取,经气相色谱-质谱联用仪分析鉴定出44种挥发性成分,其中,醇类6种、酚类1种、杂环类6种、酯类17种、硫醚类5种、醛酮类3种、其他化合物6种。通过内标法确定挥发性成分在臭豆腐中的含量为24.06 μg/g。醇类含量较高(10.43 μg/g),酯类其次(6.88 μg/g)。特征性香气成分是根据挥发性成分的香气特征和香气活性值确定。其中正丙醇、正丁醇是臭豆腐醇厚香气来源,而二甲基二硫等含硫化合物和吲哚则赋予其独有的臭味香气。也有研究认为硫化氢是发酵型臭豆腐特殊臭味的来源[17],但在以上研究中均未检测出。

3 影响臭豆腐风味物质形成的主要因素

3.1不同臭豆腐制造工艺的差异

臭豆腐因其工艺不同,其挥发性成分也不同。郑小芬等[18]以湖南本地两种臭豆腐卤水为研究对象,采用固相微萃取-气质联用技术比较分析了其挥发性成分的异同。在深色臭卤水中鉴定出挥发性风味物质38种,而浅色臭卤水中42种。丁酸丙酯、正己醇、2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯酚、正己酸、对异丙基甲苯等9种化合物在两种臭豆腐中都鉴定出。两种臭卤水中含量都不高的是2,3,5,6-四甲基吡嗪。浅色臭豆腐卤水中对异丙基甲苯、苯酚、α-松油醇3种成分的含量较高。深色臭豆腐卤水中丁酸丙酯、异戊醇、3-辛醇、正己醇等5种成分的含量较高。可能和两种臭卤水的发酵工艺不同有关。有研究人员在腐乳发酵后期添加了乙醇,并分析了乙醇对腐乳挥发成份的影响。结果发现添加乙醇的腐乳中化合物达61种,并检测到特有十二烷酸乙酯、乙偶姻等化合物,酯的含量也显著提高,而未添加乙醇的腐乳只检测到55种化合物[19]。Moy等[20]分析了酶促腐乳挥发性物质,共鉴定出包括酸类化合物、酯类化合物、酮类化合物、醇类化合物、醛类化合物等共计70 种挥发性风味成分。其中占主导地位的是醛类、醛类和脂肪酸类。其挥发性成分与霉菌发酵腐乳的不完全一致,可能是由于特定微生物引入及其代谢所导致。

3.2原料

臭豆腐是以大豆为原料,经磨浆等工艺制成豆坯,再与其他原料发酵而制成。大豆制成豆坯的过程中,由于工艺的不同,而使豆腐的成分、质地不同,进而影响腐乳的质量。如在点浆过程中,使用不同的凝固剂MgCl2、CaSO4、内酯等,所得豆腐的弹性和细腻程度也不同,从而影响后期微生物和酶的作用,并且豆腐中所含挥发性成分也不同[21]。冉春霞等[22]对全豆腐乳中的风味物质进行提取和分析并与传统腐乳成分进行了比较。发现两者的挥发性成分数量相同,但挥发性成分的种类有10%的不同。不同地区制作卤水的原料也会不同,而臭豆腐卤水又是制造非发酵型臭豆腐的核心原料。研究发现原料对卤水发酵过程中挥发性成分起关键作用。卤水中酮类物质主要来源于原料中的竹笋、苋菜和香菇。浏阳豆豉中含有10种不同的酯类物质,含量高,对于卤水中酯类物质的贡献很大[23]。青方腐乳的汤料主要有毛花卤和黄泔水等原料组成。陈涛等在青方腐乳发酵后期加入汤料,发现腐乳的游离氨基酸含量、坯体的硬度等质构参数发生了改变,同时可使腐乳产生吲哚和挥发性硫化物[24]。李雨枫等[1]探索了6种卤水配方中微生物和挥发性成分的变化。发现配方卤水中的酵母菌、细菌等数量随着配方的不同而发生变化。配方卤水中挥发性成分和传统卤水有相同的成分,但化合物的种类和成分还是有一定不同。

3.3发酵菌株

臭豆腐风味物质的形成,除受原材料和工艺的影响外,最重要是微生物及其在发酵过程中释放出的复杂酶系[25]。因此,发酵菌种对臭豆腐风味物质的形成起着最重要的作用。在非发酵臭豆腐中,卤水要经过几个月甚至更长时间的发酵。Chao等[26]分离3种(原始发酵卤水、分别浸泡了软硬豆腐的2种卤水)卤水中乳酸菌,共168个菌株。通过随机扩增多态性分析和16S rDNA测序,其中136个代表菌株被认定归属于7个属32个种:肠球菌属(2种)、乳杆菌属(14种)、魏斯氏菌属(4种)、乳球菌属(3种)、片球菌属(1种)、明串珠菌属(6种)、链球菌属(2种)。与其他两种卤水比较,原始发酵卤液中有19个不同种被分离,乳酸菌种类最多。卤水中的乳酸菌在浸泡豆腐坯前后发生了变化。郭华等[27]从臭豆腐的发酵浸泡液中筛选出两种菌:环状芽孢杆菌属和奈瑟氏菌属。通过毒理性实验验证了两株菌的安全性,并在传统工艺的基础上,对臭豆腐发酵条件进行了优化,提高了产品的风味。孙贵朋等[28]也从臭豆腐卤液中鉴定出了多种乳杆菌及芽孢杆菌,只是具体菌种略有差异。黄香华[3]等以臭豆腐发酵浸泡液为研究对象,分离得到芽孢杆菌属环状芽孢杆菌和乳杆菌属短乳杆菌2个主要菌株;并通过生理生化性能实验确定了这两株菌用来酿制臭豆腐的可行性。通过对臭豆腐挥发性成分分析,17种风味物质被鉴定出。但与传统工艺相比,其风味物质成分有所不同,其主体物质是酯类。前期研究发现臭豆腐卤水中微生物的多样性,其中乳酸菌是主要优势菌群。

发酵型腐乳在前酵阶段和后酵阶段都有微生物的参与。Han[29]等分析了不同氯化钠和乙醇含量下腐乳生产过程中微生物的变化。研究发现从豆腐到白坯的过程中好氧菌、蜡样芽胞杆菌、乳酸菌、真菌等数量增加,而在盐坯阶段减少。但腐乳成熟过程中含盐量大于8%,乙醇含量5%时,微生物稳定并且安全。腐乳生产前酵阶段多采用霉菌单菌发酵,常用的有毛霉、根霉。毛霉生产温度较低,且腐乳外观不佳;根霉温度高,但蛋白酶活力不高。崔晓红[30]等研究发现毛霉和根霉混菌发酵的豆腐乳品质优于单菌发酵腐乳。滕钰[31]等分析发现,在高温前酵的条件下,毛霉单菌酿造腐乳风味物质较少,而混菌发酵更丰富。因此,多菌种发酵可以解决腐乳高温生产问题,提高腐乳质量和风味。腐乳发酵后期,体系复杂,多种微生物和酶共同作用。王夫杰等[32]在青方腐乳分离鉴定出植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌、清酒乳杆菌。鲁绯等[33]从青方腐乳中分离鉴定出片球菌、短小奇异菌和植物乳杆菌三种乳酸菌,并将其应用于青方腐乳中。研究发现3株菌可以促进臭豆腐的成熟、增强风味,其中对于腐乳的风味作用效果最好是片球菌,可以作为改进青方腐乳品质的协同菌株[34]。因此,乳酸菌是腐乳发酵后期起重要作用,可以加快腐乳成熟和改进风味。

4 臭豆腐研究现状与发展趋势

目前,臭豆腐风味物质的研究主要集中于成分的提取和鉴定方面。而对于主要风味物质形成机理和调控研究较少。以分析化学和现代风味化学为依据,从多种挥发成分中找出臭豆腐中具有风味贡献度的物质;研究异味物质与关键风味的化学本质,探索它的形成机制和途径[35],是今后臭豆腐风味研究的趋势。

传统臭豆腐生产是在自然界多种微生物共同作用下发酵完成的,外界环境因素对其影响较大,产品质量不稳定。目前,已经从臭豆腐中分离出多种微生物,但不能从根本上揭示样品中微生物生态组成、结构特征。因此,以臭豆腐样品中全部微生物基因组为研究对象,通过高通量测序分析为手段,研究微生物多样性、种群结构和互作关系及其与环境之间的关联[36],筛选出适合工业化生产的微生物菌群是臭豆腐工业化生产的重要途径。

影响我国传统发酵食品安全的一个重要因素是各类含氮化合物代谢产生的有害胺(氨)类物质。目前,在臭豆腐中已检测出多种生物胺[37-38]。发酵过程中微生物对有机氮源选择性吸收和有害胺(氨)类物质的积累密切相关[39]。开展臭豆腐中微生物对氮源的利用和调控的研究,对提高传统发酵产品品质及安全性具有重要意义。

[1]李雨枫,徐睿烜,蒋立文,等.臭豆腐卤水发酵过程中微生物变化及风味成分研究[J].食品安全质量检测学报,2014,5(10):3088-3109.

[2]Kuba M,Tanka K,Tawata S,et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides isolated from tofuyo fermented soybean food[J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2003,67(6):1278-1283.

[3]黄香华,蒋立文,易灿. 臭豆腐菌种鉴定发酵及气味成分分析[J].农产品加工,2009(4):76-80.

[4]赵玉莲,李宏梁,郑学翔.腐乳生产菌种的选育[J].无锡轻工业学院学报,1994,13(4):310-322.

[5]鲁绯,孙君社.对腐乳后酵过程中一些成分变化的研究[J].中国酿造,2003(6):14-17.

[6]徐寅,陈霞,顾瑞霞.乳酸菌与臭豆腐品质特性的相关性研究[J].中国调味品,2010,35(10):67-69.

[7]亓顺平,翁新楚.非发酵臭豆腐挥发性风味物质的研究[J].食品科学,2007,28(12):400-404.

[8]陈涛,陈燕华,陈福生.汤料对青方腐乳后期发酵过程中主要成分、质构及臭味的影响[J]. 现代食品科技,2013,29(12):2283-2288.

[9]汪立君,李里特,齐藤昌义,等.大豆发酵食品风味物质的研究[J].食品科学,2004,25(z1):66-69.

[10]李里.臭豆腐风味产生菌的分离、鉴定及风味产生机理初探[D].武汉:华中农业大学,2010.

[11]马艳莉,刘亚琼,孙剑锋,等.青方腐乳挥发性风味物质萃取方法比较研究[J].河北农业大学学报,2015,38(4):130-133,139.

[12]Liu Y P,Miao Z,Guan W,et al. Analysis of organic volatile flavor compounds in fermented stinky tofu using SPME with different fiber coatings[J]. Molecules,2012,17(4):3708-3722.

[13]王夫杰,鲁绯.我国酱油研究现状与发展趋势[J].中国酿造,2010(12):3-7.

[14]马艳莉,刘亚琼,夏亚男,等.青方腐乳关键挥发性风味物质研究[J].现代食品科技,2015,31(5):316-321.

[15]刘玉平,陈海涛,孙宝国,等.固相微萃取与GC-MS法分析发酵型臭豆腐中的挥发性成分[J].食品工业科技,2009,30(12):403-405.

[16]孙洁雯,杨克玉,李燕敏,等.SDE结合GC-MS分析王致和臭豆腐中的特征香气成分[J].食品科学,2015,36(16):127-131.

[17]Ma Y L,Wang J H,Cheng Y Q,et al. Some biochemical and physical changes during manufacturing of grey sufu,a traditional Chinese fermented soybean curd[J].International Journal of Food Engineering,2013,9(1):45-54.

[18]郑小芬,苏悟,蒋立文.两种臭豆腐卤水中挥发性成分的比较[J].中国酿造,2013,32(10):122-125.

[19]Hwan C H,Chou C C. Volatile components of the Chinese fermented soya bean curd as affected by the addition of ethanol in ageing solution[J]. Sci Food Agri,1999,79(2):243-248.

[20]Moy Y S,Lu T J,Chou C C. Volatile components of the enzyme-ripened sufu,a Chinese traditional fermented product of soy bean[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2012,113(2):196-201.

[21]刘香英,康立宁,田志刚,等.不同凝固剂对豆腐风味的影响[J].大豆科学,2011,30(6):993-996.

[22]冉春霞,阚建全.顶空固相微萃取-气质联用技术分析全豆腐乳中的挥发性成分[J].中国调味品,2014,39(12):105-109.

[23]贺静,谢靓,刘军鸽,等.臭豆腐卤水发酵过程中挥发性成分的变化趋势分析[J].中国酿造,2016,35(7):79-84.

[24]陈涛,陈燕华,陈福生.汤料对青方腐乳后期发酵过程中主要成分、质构及臭味的影响[J].现代食品科技,2013,29(12):2283-2288.

[25]Pipong W,Sittiwat L. Comparison of determination method for volatile compounds in Thai soy sauce[J]. Food Chemistry,2003,83(4):619-629.

[26]Chao S H,Tomii Y,Watanabe K,et al. Diversity of lactic acid bacteria in fermented brines used to make[J]. International Journal of Food Microbiology,2008,123(1-2):134-141.

[27]郭华,廖兴华,周建平,等.臭豆腐菌种分离鉴定与酿造工艺研究[J].食品科学,2004,23(4):109-115.

[28]孙贵朋,张雪娇,王妍,等. 臭豆腐卤液中细菌多样性研究[J].现代食品科技,2010,26(10):1087-1091.

[29]Han B Z,Cao C F,Rombouts F M. Microbial changes during the production of Sufu-a Chinese fermented soybean food[J]. Food Control,2004,15(4):265-270.

[30]崔晓红,马力,刘平.不同菌种发酵对腐乳品质的影响研究[J].中国调味品,2016,41(11):32-36.

[31]滕钰,周鸿翔,邱树毅,等.高温条件下混菌发酵对腐乳风味化学组分影响的研究[J].中国调味品,2014,39(7):22-28.

[32]王夫杰,鲁绯,渠岩,等. 腐乳中乳酸菌的分离与鉴定[J].中国调味品,2010,35(7):98-101.

[33]鲁绯,张京生,刘子鹏,等.青方腐乳中乳酸菌的分离鉴定[J].食品与发酵工业,2006,32(4):38-41.

[34]鲁绯.乳酸菌在青方腐乳中的应用研究[J].中国酿造,2006(6):29-32.

[35]徐岩.基于风味导向技术的中国白酒微生物及其代谢调控研究[J].酿酒科技,2015(2):1-11,16.

[36]Pernille J,Jannik V,Nils A,et al. Development of quantitative PCR and metagenomics-based approaches for strain quantification of a defined mixed-strain starter culture[J]. Systematic and Applied Microbiology,2014,37(3):186-193.

[37]Guan R F,Liu Z F,Zhang J J,et al. Investigation of biogenic amines in sufu(furu):A Chinese traditional fermented soybean food[J]. Food Control,2013,31(2):345-352.

[38]Liu Z F,Wei Y X,Zhang J J,et al. Changes in biogenic amines during the conventional production of stinky tofu[J]. International Journal of Food Science and Technology,2011,46(4):687-694.

[39]周景文,堵国成,陈坚.发酵食品有害氨(胺)类代谢物:形成机制和消除策略[J].中国食品学报,2011,11(9):8-25.

Researchprogressofvolatileflavorcompoundsinstinkytofu

HOUJuan1,2,GUJing-si2,JINCheng-ri3,HEGuo-qing2,*

(1.Department of Food and Light Industry,Dezhou Vocational and Techinal College,Dezhou 253034,China; 2.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310012,China; 3.Handoksu Pyongyang University of Light Industry,Pyongyang 999093,Korea)

Volatile flavor compounds are the main special flavor of stinky tofu,and the significant index of its quality. In this paper,the formation of volatile substances in stinky tofu,the extraction methods of flavor components,the methods of identification and the influencing factors of flavoring substances were reviewed,and the research trend of stinky tofu flavor was pointed out.

stinky tofu;volatile flavor compound;identification method;research trend

2017-04-07

侯娟(1984-)，女，硕士研究生，讲师，研究方向：食品生物技术，E-mail:houjuan84@163.com。

*通讯作者:何国庆(1957-)，博士，教授，研究方向：食品微生物及发酵工程，E-mail:gqhe@zju.edu.cn。

国家自然科学基金(31571808)。

TS214.2

:A

:1002-0306(2017)16-0314-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.059