核苷（酸）类药物治疗慢性乙型肝炎患者影响HBeAg血清转换的免疫学因素研究进展*

曹辉综述，张玮审校

·综述·

核苷（酸）类药物治疗慢性乙型肝炎患者影响HBeAg血清转换的免疫学因素研究进展*

曹辉综述，张玮审校

宿主的免疫系统功能决定了乙型肝炎病毒(HBV)感染的最终转归。核苷（酸）类药物抗病毒治疗能快速降低病毒载量，恢复宿主的免疫功能，HBeAg血清转换就是宿主免疫系统功能部分恢复的标志。本文介绍了近五年这个领域的相关基础及临床研究，探讨了天然免疫和获得性免疫与HBeAg血清转换的相关性，为提高核苷（酸）类药物抗病毒治疗过程中的HBeAg血清转换率提供依据。

慢性乙型肝炎；HBeAg血清转换；先天性免疫；获得性免疫；细胞因子

HBV感染是导致慢性肝脏损伤的重要病因。全球有超过2.8亿人口为HBV慢性感染者，持续的HBV慢性感染是引起肝硬化、肝癌最主要的原因。近年来，病毒性肝炎相关死亡中一半以上都与HBV慢性感染相关[1]。在中国，HBsAg阳性的流行率超过7.18%，虽然已经实施了有效的疫苗干预，但HBV慢性感染一直是影响生活质量的危害因素[2]。

HBV慢性化机制尚未完全明确，但HBV清除已被证实与宿主HBV特异性免疫应答密切相关。在自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis，AIH）和原发性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis，PBC）的患者中，HBsAg阳性流行率远低于正常人，进一步证实了宿主的免疫应答在清除HBV感染中的重要性[3]。HBeAg血清转换的定义是指血清HBeAg、HBV -DNA检测不到，同时伴随着中和性抗体Anti-HBe的出现。HBeAg血清转换意味着宿主免疫系统已经具有控制和清除HBV的能力，形成了对HBV监控的“体系”[4]。HBsAg、HBeAg被证实对宿主的先天免疫和获得性免疫中的多种免疫元素的功能有干扰作用。抗病毒药物能快速降低病毒载量，给宿主免疫系统一个恢复的“窗口期”。HBeAg血清转换就是机体部分免疫功能恢复的标志，是先天免疫和获得性免疫共同作用的结果[5]。

1 先天免疫

先天免疫系统是非抗原特异的防护机制，在暴露于感染后可以立即或数小时内发生应答，是宿主清除病原体和控制感染的最初应答，也是抵御病原体和其他潜在威胁的第一道防线。肝脏先天免疫系统包括补体、Kupffer细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、自然杀伤T细胞（NKT细胞）和肝内树突状细胞（DC），这些免疫细胞可以针对病原微生物产生独特的免疫应答[6]。多种先天免疫细胞的精细调节对于有效清除入侵的病原体和其他威胁是至关重要的。

1.1 NK/NKT细胞NK细胞是肝脏内主要的淋巴细胞，参与组成抵御病原体的第一道防线。NK细胞无主要组织相容性抗原复合体（MHC）限制、不依赖抗体、无须预先抗原致敏，就能杀伤病毒感染细胞。NK细胞有两个表型：CD56（CD56brightNK）高表达，则其细胞毒性低，而IFNγ分泌高；低表达CD56（CD56dimNK），则细胞毒性高，而IFNγ分泌低[7]。慢性乙型肝炎患者（CHB），NK细胞分化多倾向于CD56dimNK，表现出“炎性”表型，特点是高表达活动性受体（包括CD161、CD38、KI67等）的CD56dimNK细胞，有倾向的聚集在肝脏内，表现出很强的肝细胞毒性，主要参与肝细胞凋亡，引起肝星状细胞活化，导致肝纤维化。而IFNγ仍处于低表达状态，导致了肝脏持续受损，却不能彻底清除HBV[8]。核苷（酸）类药物（NAs）治疗后，NK细胞的表型逐渐恢复至“静止”状态，活动性受体的表达水平逐渐下降。与此同时，NK细胞分化开始倾向一个利于清除HBV的表型CD56brightNK。若随着病毒载量以及抗原浓度下降，CD56brightNK细胞频数以及分泌IFN-γ的水平逐渐上升，往往在接下来的治疗中能获得HBeAg血清转换[9]。与NAs相比，Peg-IFNα对NK细胞的作用更加高效，Peg-IFNα能直接扩增CD56brightNK细胞频数，提高NK细胞的活力，增强其分泌IFNγ的功能。CD56brightNK细胞是NK细胞最早分化的亚群，早于CD56dimNK细胞，它们能优先和DC细胞相互作用，在早期先天免疫应答以及获得性免疫应答中占据重要的作用[10]。IFN和NAs联合治疗不但能促使HBeAg血清转换，还能提高HBsAg阴转率，这与改变NK细胞的表型和功能密切相关[11]。Femke等[12]发现Peg-IFNα联合阿德福韦治疗获得HBeAg血清转换、HBsAg阴转的CHB患者，CD56dimNK细胞频数明显下降，其表面抑制性受体NKG2A、趋化因子受体CX3CR1呈低表达；而CD56brightNK细胞频数明显升高，并分泌高水平的IFNγ。其细胞表面，能使NK细胞表现出肝毒性的活动性受体CD161低表达，肿瘤坏死因子凋亡相关的调导配件（TNF-related apoptosis-indueing ligand，TRAIL）高表达，TRAIL可以介导机体特异性地清除肝细胞中的病毒。总之，CD56brightNK细胞频数升高，有助于在抗病毒治疗过程中获得HBeAg血清转换。

NKT细胞是一类特殊的T细胞亚群，同时表达NK细胞和T细胞的表面标志物。在HBV感染的动物模型中NKT细胞能分泌抗病毒因子IFNγ和TNFβ参与控制HBV复制[13]。NKT细胞按照表型和功能分为CD4+NKT和CD4-NKT。HBV慢性感染者，NKT细胞主要以CD4+NKT占优势。CD4+NKT细胞主要分泌抗炎类细胞因子诱导免疫耐受，CD4-NKT主要分泌Th1类细胞因子，促使Th1免疫应答，清除病毒。随后，jiang等[14]发现接受NAs获得HBeAg血清转换的患者，CD4-NKT/CD4+NKT比值明显高于没有出现的患者。提示HBeAg血清转换与NKT细胞的表型密切相关。

1.2 DC细胞DC是经典的抗原递呈细胞，摄入和提呈抗原后可活化CD4+和CD8+T细胞。此外，DC细胞还是体内Ⅰ型IFN的主要来源,Ⅰ型IFN主要参与调节肝脏内局部免疫应答[15]。HBV慢性感染后，随着HBeAg浓度升高，DC细胞数量逐渐减少，幸存的DC细胞开始低表达CD80、CD86、HLA-DR等共刺激分子，使DC细胞的抗原提呈功能减弱以及分泌IL-10水平上升，进一步导致Th1以及细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）的效应下降。Lin等[16]调查发现与处于免疫耐受期的HBV感染者相比，自然获得HBeAg血清转换的HBV感染者，DC细胞表现出强大的抗原提呈及分泌IL-12等促炎细胞因子的功能。随后，wei等[17]发现用恩替卡韦加自体DC细胞治疗CHB患者，发现HBeAg血清转换率明显高于恩替卡韦单药组。展现出了DC细胞在HBeAg血清转换中不可或缺的作用。

1.3 TLRTOLL样受体（TOLL-like receptor，TLR）常表达于肝细胞、DC细胞、Kuffper细胞和肝血窦内皮细胞膜表面和胞浆中，经病原相关分子（PAMP）激活，发挥信号传感器作用。HBV多种抗原分子（如HBsAg、HBeAg）可激活多种TLR受体（如TLR2、TLR4、TLR7），TLR与病原分子结合后，经细胞内途径，如核因子（NF）-KB，产生各种细胞因子如TNFα、IL-6、IL-12、IFNγ、趋化因子来清除HBV[18]。但HBV也有相应的拮抗机制，HBV病毒颗粒、HBsAg、HBeAg能降低TLR的表达，或抑制TLR途径激活的先天免疫，从而促使HBV感染慢性化[19]。HBV还能下调模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）的表达，阻止PRR-PAMP相互作用，干扰下游信号转导通路来阻止PRRs激活以及下游IFNγ及核因子（NF）-K B相关炎性因子（如TNFα）释放[20]。

影响到HBV感染的转归与单核细胞TLR2的表达水平直接相关。TLR2主要表达在单核细胞上，经TLR2配体（Pam3csk4）刺激，分泌TNF-a、IL-6、IL-10。肝细胞内的HBeAg，可以干扰TLR2活化所需的MyD88与TRAM和（或）Mal的相互作用来阻止TLR2信号转导通路，而血清中的HBsAg能选择性的关闭JNK-MAPK信号通路，抑制Pam3csk4，从而降低IL-12的分泌。IL-12是重要的免疫调节因子，是连接先天免疫和获得性免疫的桥梁，其主要功能是辅助T细胞的增殖和分化，促进Th1细胞的免疫应答以及分泌IFNγ,还能促使CD8+T细胞充分发育CTL细胞以及增强它们的杀伤能力[21]。故而当JNK-MAPK信号通路关闭时则更难清除HBsAg。Huang等[22]研究佐证了这一观点，他发现接受NAs治疗后，随着病毒抗原浓度下降，单核细胞表达TLR2水平逐渐上升的CHB患者，都能在后续的治疗中获得HBeAg血清转换。与NAs相比，PEG-INFα治疗获得HBeAg血清转换率显著升高，可能与PEG-INFα不仅能提升TLR2的表达，还能提高Pam3csk4的活性相关[23]。

TOLL样受体中的TLR-7受体主要表达在浆样树突状细胞（pDCs）和B淋巴细胞的核内体区域中，其作用是识别病毒的单链RNA（Single strand RNA，ssRNA）。TLR-7刺激上调，能促使pDC细胞分泌IFNα和其它的细胞因子/趋化因子，诱导NK细胞活化以及激活细胞毒性淋巴细胞[24]。此外，Lanford等[25]还发现TLR7被激活后，还能提高干扰素刺激基因（ISG）的表达，促进pDC细胞产生I型IFN，从而清除HBV。显然，Toll样受体能精密的协调先天免疫和获得性免疫应答，在宿主清除HBV中占据重要的角色，可为彻底清除HBV带来曙光。

2 获得性免疫

长期暴露于高水平病毒抗原下，T细胞被大量耗竭，功能严重受损，受损程度与病毒载量成正比。残存功能低下的T细胞表达高水平的共抑制性受体，如程序性死亡分子1（Programmed death 1，PD-1）、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin-3，Tim-3），影响T细胞的应答和分化[26]。正是基于上述原因，在HBV感染时，获得性免疫反应表现为延迟、持续时间短和窄谱的T细胞应答，表现为免疫耐受。

2.1 Th1/Th2细胞Th1、Th2是CD4+Th细胞的亚群，CD4+Th细胞因细胞环境不同分化为功能不同的亚型。HBV慢性感染后，极高浓度的抗原肽、肝内微环境中相当丰富的IL-10、TGFβ、精氨酸酶等有助于CD4+Th细胞极向分化，导致Th1、Th2细胞频数明显比健康人少，且分泌Th1、Th2样细胞因子能力差[27]。抗病毒治疗能改善这一缺陷。Peg-IFNα能诱导CD4+Th细胞偏向Th1和Th2分化，虽然它们被认为是促炎细胞，分泌促炎因子，加重肝脏损伤。但Peg-IFNα诱导后分化的Th1、Th2细胞主要分泌IFγ、IL-2、TNFα等细胞因子以非细胞毒途径清除肝内的HBV，降低HBV载量，减少病毒蛋白合成，虽然HBsAg清除率不高，但HBeAg血清转换率明显上升[28]。随着血清HBV DNA载量、抗原浓度下降，若CD4+Th细胞分化开始以Th1、Th2占优势，往往能获得HBeAg血清转换[29]。You等[30]随访长疗程接受恩替卡韦治疗获得HBeAg血清转换的CHB患者，发现其Th1、Th2细胞频数以及Th1、Th2样细胞因子明显比基础水平多。未实现HBeAg血清转换的患者，没有出现类似的现象，Th1、Th2细胞频数和Th1、Th2样细胞因子仍然较低。因此，他认为Th1、Th2细胞免疫应答强度，在HBeAg血清转换中至关重要。

Th1、Th2免疫应答增强，表现在它们分泌的细胞因子水平上升。Th1细胞分泌IL-2、IFNγ、TNFα，能促使CD8+T细胞活化成高效的CD8+CTL细胞，在基因转录和转录后层面抑制HBV复制；还能维护CD8+T细胞分化、增殖、代谢以及凋亡的关键调节器AKT、mTOR的功能。HBV持续感染时，CD8+T细胞上的AKT、mTOR调节功能受损，FOX01效应作用上升。FOX01作为PD-1的转录激活因子，促使CD8+T细胞分化成功能低下的效应CD8+CTL细胞，这种细胞的特点是对病毒抗原不敏感，细胞毒性低，通过Fas/FasL或穿孔素直接杀伤感染的肝细胞途径减弱以及分泌IFNγ等细胞因子减少[31]。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10，主要作用是支持B细胞的激活和增殖，辅助HBV特异性B细胞产生高水平的抗体。Rong[32]发现基础Anti-HBc滴度与HBeAg血清转换率高度相关，Anti-HBc包括IgM和IgG由HBcAg-特异性B淋巴细胞分泌。他认为基础高滴度的Anti-HBc可能与Th1、Th2细胞高度免疫应答相关。

此外，Th1/Th2样细胞因子的水平及比值在清除HBV中也起到了重要的作用。Tang[33]等从关于小鼠HBV感染模型中发现，下调细胞因子信号转导抑制因子SOCS1和SOCS3，能显著提高Th1、Th2细胞频数以及Th1/Th2样细胞因子的比值。SOCS1和SOCS3已经被证实是重要的T细胞分化调节信号，能干扰CD4+Th细胞分化的信号通路STAT1和STAT4。HBV可通过上调SOCS1和SOCS3的表达，影响宿主CD4+Th细胞的分化。NAs治疗能快速抑制病毒的复制，降低病毒对CD4+Th细胞分化信号通路的干扰。在接受NAs治疗获得HBeAg血清转换的患者，Th1/Th2样细胞因子的比值显著上升，具体表现在Th1型细胞因子IL-2、TNFα、IFNγ水平上升，Th2型细胞因子lL-6、IL-10水平下降等[34]。Chokshi[35]的研究得到了相似的结果，他发现在获得HBeAg血清转换的CHB患者外周血中，IL-2,TNF-a、IFNγ的含量显著上升，而没有获得的HBeAg血清转换的CHB患者，TGFβ、lL-6、IL-10含量上升。

2.2 调节性T细胞（Treg）Treg细胞由CD4+Th细胞分化而来，极化因子为TGFβ，主要分泌IL-10、TGFβ细胞因子。Treg细胞通过细胞直接接触或分泌IL-10、TGFβ间接抑制多种淋巴细胞反应，从而抑制HBV的清除反应，导致感染慢性化[36]。急性肝衰竭（ACLF）发生时，活化的促炎细胞、促炎因子、趋化因子受体可以诱导Treg的产生，并募集其他抗炎细胞至肝脏，抑制过度的肝脏免疫损伤，促进肝脏修复，保护肝脏。提示Treg细胞在维持对内源性和外源性抗原免疫耐受的重要性[37]。Yang[38]比较了HBV慢性感染者与健康人的外周血发现，HBV慢性感染者外周血中调节性B细胞（Regulatory B cell,Breg）、Treg细胞频数明显比健康人多，且与HBV载量呈正相关。Breg细胞能促使CD4+Th细胞偏向Treg细胞分化，并提高Treg细胞上FOXP3和CTLA-4的表达来促进IL-10，TGF-B的分泌，从而抑制Th1细胞、Th17细胞的免疫应答[39]。抗病毒治疗能降低外周血中Treg细胞频数。从Yang等[40]研究可以反映出来。他发现接受TDF抗病毒治疗获得HBeAg血清转换的CHB患者，其外周Treg细胞频数明显下降，而在没有获得的患者中，Treg细胞几乎不下降。有趣的是，他还发现在获得HBeAg血清转换的患者，Treg细胞T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）/β链可变区（Vβ），Vβ家族中以Vβ14，Vβ20，Vβ24高表达。没有获得HBeAg血清转换的患者，Vβ家族中以Vβ12，Vβ15，Vβ22高表达。β链可变区（Vβ）能对病毒表位肽进行特异性识别，是与表位肽/MHC-I复合体最密切联结的TcR部分。Vβ家族不同成员的比例，直接关系到CTL细胞对病毒抗原的应答性[41]。基于此，是否可以将Treg细胞频数以及Vβ家族中的分子型作为预测HBeAg血清转换的指标，这需要更加深入的研究。

2.3 滤泡辅助性T细胞（Tfh）大部分抗原需要与Tfh细胞或Tfh细胞分泌的细胞因子接触才能激活体液免疫，Tfh细胞的特征是高表达化学趋化因子受体CXCR5。CXCR5+Tfh细胞的特性与CXCR5+CD4+T细胞相似，后者在循环血液中的频数可以反应出前者在淋巴组织中的频数[42]。在生发中心（Germinal center），CXCR5+Tfh细胞的主要作用是辅助Anti-HBe分泌性B细胞分泌抗体Anti-HBe中和HBeAg[43]。Tfh细胞可通过CD40/CD154等多种受体/配体与B细胞结合，辅助抗原特异性B细胞分化成记忆性B细胞或浆细胞[44]。Tfh细胞与B细胞相互作用的强度与HBeAg的血清转换率之间存在相关性。Zhang等[45]研究发现，接受Peg-IFNα治疗获得HBeAg血清转换的CHB患者，外周血中CXCR5+CD4+T、CD19+CD38+B细胞频数明显增多，且CXCR5+CD4+T细胞表面高表达共刺激受体/配体ICOS、CD40L，低表达共抑制受体PD-1。CD19+CD38+B细胞高表达ICOSL、CD40，低表达PD-L1，而在没有获得HBeAg血清转换的CHB患者中，这种情况是截然相反。CXCR5+CD4+T细胞表达的共刺激受体CD40与B细胞表达的配体CD40L之间相互作用，能诱导产生浆细胞和记忆性B细胞，还能加速抗体的成熟，促进抗体与抗原之间的亲和力。CD19+CD38+B细胞表达的配体ICOSL上调，能促使Tfh细胞活化，促进IL-21分泌。IL-21是Tfh细胞最重要的辅助信号分子，血清中IL-21的水平可作为预期HBeAg血清转换的生物学指标[43]。然而，Lei et al[46]发现CHB患者外周血中CXCR5+CD4+T细胞过度活化（表现在CXCR5+CD4+T细胞频数增多，辅助B细胞产生高水平的抗体），但HBeAb和HBsAb的分泌却无明显改观。此外CXCR5+CD4+T细胞过度的免疫应答，不仅与肝脏炎症密切相关，还能产生ANA、AMA、ss-A、ss-B、scl-70、nRNP/sm等多种自身抗体，有诱发肝外自身免疫性疾病的可能。因此，Tfh细胞所介导的体液免疫在清除HBV感染中的免疫作用需进一步探索。

3 结语与展望

免疫学因素在清除病毒中发挥重要的作用。抗病毒治疗后，随着HBV-DNA、HBsAg、HBeAg等浓度下降，先天免疫和获得性免疫中多种免疫元素功能逐渐恢复，分泌具有清除病毒作用的细胞因子明显增多，HBeAg血清转换是宿主免疫部分恢复的结果，意味着宿主的免疫系统出现重建。但是这种抗病毒治疗带来的免疫重建是不稳定的，终止抗病毒药物后，宿主的免疫系统可表现出持续低效的免疫应答，甚至又有可能回到免疫耐受的状态。抗病毒治疗对免疫系统的影响很复杂，多种免疫细胞的相互作用、抗炎因子与促炎因子之间的平衡以及共刺激受体与共抑制受体的相互协调机制仍需深入研究，以期为安全停药及清除HBsAg提供新的治疗策略。

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（收稿：2016-10-10）

（本文编辑：朱传龙）

Research Progress of Immunological factors influencing HBeAg seroconversion across chronic hepatitis B patients treated with nucleos(t)ide analogues

Cao Hui,Zhang Wei.Department of Liver Diseases,Longhua Hospital,Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200030,China

The function of host immune system determines the final outcomes of hepatitis B virus(HBV)infection.Antiviral treatment by nucleos(t)ide analogs can quickly reduce the viral loads and recovery host immune function.HBeAg seroconversion is a sign for at least a partial host immune system recovery.This paper reviews the relevant basic and clinical research in the nearly last 5 years to explore the correlation between innate immunity and acquired immunity with HBeAg seroconversion and tries to provide evidence for the improvement of HBeAgseroconversionrate in the nucleos(t)ide analogs treatment process.

Hepatitis B;HBeAg;Innate immunity;Acquired immunity;Cytokine

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.035

国家自然科学基金项目（编号：81373860）;上海市中医中西医临床重点扶持项目（编号：ZY3-JSFC-1-1009）

200030上海市上海中医药大学附属龙华医院肝病科

曹辉，男，26岁，硕士研究生。主要从事中西医结合治疗肝病研究

张玮，E-mail：18918104444@189.cn