黄芪和三七成分结合对脑缺血/再灌注小鼠NF—κB信号通路及炎性因子的影响作用

王加良+丁禄荣+丛军兹+尹昌浩

[摘要] 目的 研究黄芪和三七成分结合对脑缺血/再灌注小鼠Nα，NF-κB信号通路和炎性因子的影响作用。 方法 该次研究地点为牡丹江医学院红旗医院药剂科，2016年2—10月选取SP大鼠 45只分为假手术组、脑缺血再灌注组、黄芪多糖治疗脑缺血再灌注组，每组15只，其中假手术组只进行大脑中动脉的剥离不进行栓塞。脑缺血再灌注组、黄芪多糖治疗脑缺血再灌注组 进行 线栓法 阻塞 大脑中动脉2 h后 放开模拟脑缺血再灌注的条件。进行各时间点缺血再灌注后3、6、24、72 h的各个指标的变化。结果 脑缺血/再灌注后，脑组织TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表达增加，分别为（3.58±0.19）、（1.06±0.18）、（2.39±0.27）。黄芪可以降低TNF-αmRNA的表达（2.58±0.16），三七可以同时降低TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表达，分别为（0.65±0.11）、（1.79±0.23）。两种药物的配伍可以显著抑制炎性细胞因子的表达效果。脑缺血/再灌注后，胞质NF-κB蛋白表达显著减少，胞核NF-κB蛋白表达增加，NF-κB的核转为率升高。 结论 黄芪和三七的主要成分配伍可以有效抑制缺血/再灌注后的脑组织NF-κB信号通路的激活，进而减少炎性细胞因子的生成，进而减轻脑缺血后脑组织继发炎症，更好的保护脑组织。

[关键词] 黄芪；三七；脑缺血/再灌注；小鼠NF-κB信号通路；炎性因子

[中图分类号] R285 [文献标识碼] A [文章编号] 1674-0742（2017）01（c）-0028-04

Effect of Astragalus Membranaceus and Sanqi Component on the NF-κB Signal Channel and Inflammatory Factor of Cerebral Ischemia-reperfusion Mice

WANG Jia-liang1， DING Lu-rong1， CONG Jun-zi1， YIN Chang-hao2

1.Department of Pharmacy， Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China；2.Department of neurology， Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China

[Abstract] Objective To research the effect of astragalus membranaceus and sanqi component on the NF-κB signal channel and inflammatory factor of cerebral ischemia-reperfusion mice. Methods 45 SP rats in department of pharmacy，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical Colkge from February to October 2016 were selected and divided into three groups with 15 cases in each， the Sham-operated group were given only brain arterial dissection but not embolism， and the cerebral ischemia-reperfusion group and the astragalin treatment for cerebral ischemia-reperfusion group released the condition of stimulating cerebral ischemia reperfusion after blocking the brain artery by the suture-occluded method， and the changes of various indexes at 3，6，24，72 h after the ischemia-reperfusion at each time point were observed. Results After the cerebral ischemia-reperfusion， the brain tissue TNF-α，IL-β and ICAM-1mRNA expression could increase， （3.58±0.19）， （1.06±0.18）， （2.39±0.27）， and Astragalus membranaceus could reduce the expression of TNF-αmRNA， （2.58±0.16） and Sanqi could reduce the expression of TNF-α，IL-β and ICAM-1mRNA （0.65±0.11） and （1.79±0.23）， and the combination of the two drugs could obviously inhibit the expression effect of inflammatory cytokines， after cerebral ischemia-reperfusion， the expression of kytoplasm NF-κB protein obviously decreased， and the expression of karyon NF-κB protein obviously increased and the examination and transmission rate of NF-κB increased. Conclusion The compatibility of astragalus membranaceus and sanqi can effectively inhibit the activation of brain tissue NF-κB signal channel after the cerebral ischemia-reperfusion thus reducing the production of inflammatory cytokines and relieving the brain tissue secondary inflammation after the cerebral ischemia and better protecting the brain tissues.

[Key words] Astragalus membranaceus； Sanqi； Cerebral ischemia-reperfusion； NF-κB signal channel of mice； Inflammatory factor

脑血管病在临床上是常见及多发病，并且是当前3大致死疾病中的一种，该病有着较高的发病率、病死率、致残率，缺血性脑血管病患者的人数在近几年出现了上升[1-2]。缺血性脑血管病特别是脑缺血后再灌注损伤，有着极大的危害。脑缺血再灌注损伤指的是脑缺血造成的脑细胞损伤，将血液再灌注恢复之后，缺血性损伤会出现加重的情况[3-4]。此次研究时间为2016年2—10月，主要内容是研究黄芪和三七成分结合对脑缺血/再灌注小鼠Nα，NF-κB信号通路和炎性因子的影响作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

SPF级的雄性C57BL/6小鼠45只，体质量18～22 g，年龄6个月～1年，由湖南省维通利华实验动物有限公司提供，合格证为：SCXK（湘）2009-0004。饲养在SPF级动物实验室，湿度是45%，温度是25℃。脑缺血再灌注的动物模型的制备：用头端处理的尼龙钓丝，从颈外动脉向颈内动脉插入，可逆性阻断大鼠一侧大脑中动脉（MCA）。2 h后抽出钓线，制作成脑缺血再灌注的动物模型。将分为假手术组、脑缺血再灌注组、黄芪多糖治疗脑缺血再灌注组，每组15只；两组样本的一般情况差异无统计学意义（P>0.05），可以进行比较。

1.2 方法

其中假手术组只进行大脑中动脉的剥离不进行栓塞。脑缺血再灌注组、黄芪多糖治疗脑缺血再灌注组进行线栓法阻塞大脑中动脉2 h后放开模拟脑缺血再灌注的条件。进行各时间点缺血再灌注后各个指标的变化。①缺血再灌注后各个时间点的病理变化，组织化学染色证实脑缺血模型是否成功（包括小血管内皮的损伤，神经元的损伤）。②电镜下利用伊文思兰 （evansblue，EB）的渗透性评估血脑屏障的通透性，透射电镜观察血脑屏障超微结构的变化。③RT-PCR法检测不同时间点 TLR4 、MyD88 mRNA水平的变化。④Westblot 法检测不同时间点 TLR4 、MyD88 蛋白水平的变化。⑤ELISA法检测IL-1、IL-6、TNF-a的量的变化。

1.3 统计方法

实验数据通过SPSS 18.0统计学软件分析处理，先将各组的数据通过方差齐性检验，多组间对比采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 脑缺血/再灌注后，脑组织TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表达会增加

黄芪可以降低TNF-αmRNA的表达，三七可以同时降低TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表达。两种药物的配伍可以显著抑制炎性细胞因子的表达效果。脑缺血/再灌注后，胞质NF-κB蛋白表达显著减少，胞核NF-κB蛋白表达增加，NF-κB的核转为率升高。详情见见表1。

2.2 各组脑组织的p-IkBα、胞核NF-kB蛋白表达、胞质和NF-kB核转位率对比

和假手术组比较，脑缺血灌注组的p-IkBα蛋白表达显著增加。黄芪多糖治疗组降低p-IkBα蛋白表达的效果要强于各组。见图1。

3 结论

缺血再灌注属于缺血后的一种比较特殊的状态，能够对原来的缺血性损伤进行加重。它的产生机制当前并不十分清楚。Cao等[5]得知TLR4-/-小鼠在出现脑缺血再灌注后，脑损害程度要比野生鼠轻，血清TNF-α含量出现了显著降低。针对体外培养BV-2细胞模拟脑缺血再灌注，同样得到近似度较高的结果，运用逆转录多聚酶链反应（ RT-PCR）法对TLR4和核因子-κB（NF-κB） mRNA表达进行检测后得知其出现了显著增高，TNF-α水平同样也出现了增高。以此可以可以推导得知TLR4参与了脑缺血再灌注后炎症损伤的整个过程。Hua等利用鼠全脑缺血再灌注模型研究得知，野生鼠假手术组内，脑组织内不存在TLR4表达；而GCI/R后的72 h中，野生鼠海马区及尾状核保持在TLR4免疫活性；扣带后回以及其它皮质区、丘脑前核、内囊、胼胝体等白质也有免疫活性，只是其活性很低；此外还得知，野生鼠NF-κB活性及磷酸化κB抑制因子都出现了升高，降低的是TLR4-/-的炎症酶原水平。上述内容显示，脑缺血再灌注后， TLR4信号通路得到激活，同时关系着抑制 （PI-3K） /Akt的信号通路，后者主要是抑制凋亡、促进增殖的关键信号通路[6]。

黄芪的作用是补气固表。其中含有大量的多糖、蛋白质、黄酮类、甙类、生物碱、氨基酸、微量元素等活性物质 ，多糖免疫活性最佳[7-8]。自20世纪 80年代以来 ，关于对黄芪多糖 （APS）的研究报道中得知 ：自黄芪根内提取出的多糖APS是葡萄糖及阿拉伯糖多聚糖 ，毒性低 ，存在十分广泛的的免疫增强及抗病毒功能，可以解除植物血凝素 （PHA）毒性用，能有效抑制抗免疫抑制药物如强松龙 （PDS）、环磷酰胺 （Cy）等。黄芪多糖的免疫药理学研究现状主要涉及几个方面：①调节肌体免疫功能：白介素-2（IL-2）可以提升巨噬细胞和自然杀伤细胞（NK）杀伤性；②直接调节对肌体存在重要免疫功能的T及B细胞分化增生。

脑缺血/再灌注后，脑组织TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表达会增加，分别为（3.58±0.19）、（1.06±0.18）、（2.39±0.27）。黄芪可以降低TNF-αmRNA的表达（2.58±0.16），三七可以同时降低TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表达，分别为（0.65±0.11）、（1.79±0.23）。两种药物的配伍可以显著抑制炎性细胞因子的表达效果。脑缺血/再灌注后，胞质NF-κB蛋白表达显著减少，胞核NF-κB蛋白表达增加，NF-κB的核转为率升高。此次研究结果和邓冰湘等人[9]的研究结果基本一致，具有研究意义。

综上所述，该研究旨在通过研究黄芪多糖对脑缺血再灌注后TLR4/MyD88信号通路的影响的机制，为临床应用提供理论依据。

[参考文献]

[1] 黄小平，卢金冬，丁煌，等.黄芪和三七的主要有效成分配伍对脑缺血/再灌注小鼠NF-κB信号通路及炎性因子表达的影响[J].中国药理学通报，2015（1）：141-146.

[2] 赵东辉.缺血性心脑血管病治疗中抗栓药物的新进展[J].中外医疗，2012，31（23）：181.

[3] 王树林，安芳.中药对脑缺血再灌注损伤保护作用及机制研究进展[J].神经药理学报，2014（3）：39-48.

[4] 任翔，周文胜.丹紅注射液对大鼠脑缺血再灌注神经细胞凋亡的影响[J].中外医疗，2011，30（12）：18-19.

[5] 柏江锋.中医药改善脑缺血再灌注损伤的实验研究进展[J].河南中医，2012（12）：1715-1720.

[6] 姜丽，宁可，包怡敏.三七总皂苷抗缺血再灌注损伤机制研究进展[J].中华中医药学刊，2016（2）：267-270.

[7] 邱咏园， 唐映红， 王蓓，等. 黄芪和三七4种有效成分配伍对小鼠脑缺血再灌注早期抗氧化应激物质活性的影响[J]. 中华中医药杂志， 2014（6）：1940-1943.

[8] 黄小平， 欧阳国， 丁煌，等. 黄芪甲苷与三七有效成分配伍对小鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和内质网应激的影响[J]. 中草药， 2015， 46（15）：2257-2264.

[9] 邓冰湘， 卢金冬. NF-κB信号通路在脑缺血再灌注损伤中的作用及中药有效组（成）分的干预研究[J]. 湖南中医药大学学报， 2014， 34（7）：54-58.