食源性蛋白质自组装及其应用

许 威,赵昕梅,袁红雨,李佩忆,罗登林,李莹莹

(1.信阳师范学院生命科学学院,河南信阳 464000;2.大别山农业生物资源保护与利用研究院,河南信阳 464000;3.河南科技大学食品科技学院,河南洛阳 471023)

食源性蛋白质自组装及其应用

许 威1,2,赵昕梅1,2,袁红雨1,2,李佩忆1,罗登林3,李莹莹1

(1.信阳师范学院生命科学学院,河南信阳 464000;2.大别山农业生物资源保护与利用研究院,河南信阳 464000;3.河南科技大学食品科技学院,河南洛阳 471023)

天然、无毒、可降解及较好的生物相容性,使得基于食源性蛋白质自组装体系在食品及材料领域占据越来越重要的地位。本文介绍了常见的蛋白质自组装形式,包括常见蛋白质的自组装、蛋白质-蛋白质自组装、蛋白质-多糖自组装、蛋白质糖基化自组装及蛋白质-无机材料自组装形式,并简介了蛋白质自组装的应用。

蛋白质,自组装,纳米凝胶,应用

食源性大分子自组装利用可食性食品大分子之间非共价键的相互作用,实现在纳米、微米等不同尺寸上的规则结构的构建,该技术简便易行,已经引起了越来越多研究者的兴趣,特别在蛋白质电荷调节、凝胶特性的研究方向,更是受到食品与材料研究者的青睐。近年来多种食源性植物蛋白质、动物蛋白质,由于原料天然无毒,自组装方式绿色,已被广泛研究。该方面的研究不仅可以拓展食品理念、改善食品结构,对建立新型食品体系有重要的实际指导意义,同时也丰富了食品材料学的外沿,为其绿色合成提供更多空间,符合我国“环境低负荷、低能耗、低成本、绿色天然”的发展理念。

1 蛋白质自组装

1.1 酪蛋白

牛乳中95%以上酪蛋白以胶束形式存在,尺寸一般在148～220 nm[1]。胶束的内部结构及组成十分复杂,目前只能依靠一些模型来描述和解释,比较成熟的结构模型有套核模型、内部结构模型、亚单元模型及Holt模型等电荷[2]。该胶束可以作为药物等载送体系,如β-酪蛋白自组装纳米凝胶包载紫杉醇、叶酸等,使其在溶液中具有较好的稳定性、抗消化性、低毒性及缓释特性[3-4]。许多方法已被用于酪蛋白的改性,包括物理、化学及酶的方法等,进而改变其自组装特性。如在酪蛋白上接枝甲基丙烯酸甲酯,制备80～130 nm,以聚甲基丙烯酸甲酸为核,酪蛋白为壳的纳米粒子[5]。作为天然自组装体的酪蛋白具有先天优势,使其在蛋白质自组装体研究中占有非常重要的地位。

1.2 白蛋白

白蛋白纳米载体具有高度靶向、药物控制释放性,可提高难溶药物的溶解度;当药物与白蛋白结合后,可阻止药物从注射部位的释放,使药物缓慢释放从而延长药效。作为目前应用最广泛的药物载体白蛋白纳米粒的制备方法很多,最常应用的方法有乳化固化法、去溶剂化法及超临界溶液法等[6]。如用戊二醛与单抗偶联制备成免疫纳米球,当药物浓度达到0.3 μmol/mL可对M3细胞有特异性杀伤作用,而对正常人细胞杀伤效果不明显,具有一定的靶向性[7]。刘海等也合成叶酸偶联牛血清白蛋白,并用去溶剂法制备白蛋白纳米,选用肺癌细胞为靶细胞,也研究了偶联药物纳米的靶向性[8]。

1.3 转铁蛋白

转铁蛋白受体是一类很好的肿瘤靶向分子,这是因为肿瘤细胞表面含有104～105转铁蛋白受体分子,转铁蛋白可以通过受体调控的细胞内吞作用进入细胞,而且还可与药物结合[9]。Yang等通过巯基乙酸将转铁蛋白共价连接到金纳米粒子表面形成了100 nm左右的粒子,在生理条件下进行培养观察发现偶联转铁蛋白的金纳米粒子可通过人鼻咽癌细胞内吞作用被细胞吸收[10]。Tanaka等利用戊二酸酐与丝裂霉素合成戊二酸丝裂霉素,再与转铁蛋白作用,通过受体介导的细胞内吞作用增强了丝裂霉素的Hep-G2肝癌细胞摄取率[11]。

1.4 其它蛋白质

大豆蛋白、溶菌酶等的自组装体也常作为营养和药物输送体系。如利用大豆蛋白热诱导下自组装体,研究其界面吸附动力学及稳定乳液的行为[12]。我们课题组也利用溶菌酶、低密度脂蛋白与羧甲基纤维系自组装并分别对5氟尿嘧啶和阿霉素进行包载,研究体外控释行为及分析药物毒性,并探究其抗癌活性[13-14]。

蛋白质可通过去溶剂、热处理、超声等多种方法形成自组装体,在自组装过程中,食源性蛋白质空间结构发生变化。特别是热处理后的蛋白质自组装体表现出一定的抗消化性和凝胶特性,使之在营养及药物递送体系中不仅仅表现出尺寸效应,还能起到控制和缓释的效应。

2 蛋白质-蛋白质自组装

19世纪末Kossel首次发现鸡蛋蛋白和鱼精蛋白相互作用后会产生沉淀,从而揭开了阴阳聚电解质静电相互作用研究的序幕。白蛋白和溶菌酶在弱酸性溶液中混合时,在溶菌酶的等电点附近二者可形成静电络合物,并发生分子重排,加热后两种蛋白质变性并在疏水和二硫键作用下自组装形成稳定的纳米凝胶[15-16]。卵转铁蛋白和白蛋白,在pH及热联合效应下可形成纳米水凝胶,将卵转铁蛋白与白蛋白分子偶联后再进行组装,获得广泛pH条件下稳定的纳米凝胶。Nigen等利用多种显微技术对乳白蛋白和溶菌酶微球的组成、形成机制进行了研究,通过蛋白质标记等技术发现两种蛋白微球的组成是随时间变化的,且微球的形成与蛋白浓度有很大关系,遵从聚集-重组规律,这一点与Ostwald熟化现象很相似[17]。蛋白质与蛋白质在其互作的基础上可自发自组装,也可能量诱发自组装行为的发生,可充分利用食源性蛋白质电解质特性的差异性,在静电复合体系的基础上进一步组装,组装原理逐渐被提示,为蛋白质-蛋白质组装行为的预判提供了理论依据。

3 蛋白质-多糖自组装

蛋白质能迅速被胃肠道消化酶降解破坏,临床应用受到较大限制。使用带电荷的多糖,如壳聚糖、羧甲基纤维素等,既可通过电荷,又可通过其疏水基团与蛋白质药物的脂溶性基团相互作用,双重作用更有利于纳米载体对蛋白质、肽类等药物的负载。两亲性壳聚糖衍生物与牛血清蛋白的自组装体在药物输送方面的表现出良好的效果,并随着多糖浓度升高药物包封率进一步提高[18]。Qi等研究牛血清蛋白接枝葡聚糖,并与壳聚糖制备核壳结构纳米胶束具有较低的毒性,同时还有较好的药物载送能力[19]。通过加热制备乳铁蛋白纳米粒子,再与果胶、藻酸盐及卡拉胶等通过静电结合,在胃液、胰液均表现出抗消化行为,说明多糖修饰可以调控蛋白质的消化性。溶菌酶与肝素形成复合物后有助提高溶菌酶的稳定性,维持溶菌酶原有结构,保持其活性[20]。多糖的引入一方面可改善蛋白质单一特性,如消化性,为载送体系的多方面应用奠定基础;同时还可以增加自组装的疏水性,提高载运物的包封率和缓释性能。

4 蛋白质-糖基自组装

Malllard反应和蛋白质加热凝胶化实现球状蛋白和葡聚糖的组装,蛋白质在加热条件下变性并发生凝胶化,通过结合到蛋白质上的葡聚糖抑制了蛋白质宏观聚集,从而在生理pH和离子强度下赋予其更高的稳定性。如李娟实现基于球状蛋白和亲水性多糖制备核壳结构的纳米凝胶的制备方法,制备了溶菌酶-葡聚糖共价结合物,然后通过热诱导得到200 nm的溶菌酶-葡聚糖纳米凝胶粒子,具有较好的稳定性和分散性。潘晓赞研究了Malllard反应制备酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物及其胶束化行为,研究表明共价接枝的葡聚糖阻止了胶束宏观沉淀的形成,酪蛋白共聚物的胶束具有球状外貌,接枝、葡聚糖的分子量决定了胶束的尺寸,该胶束较强的疏水性可以包埋芘等疏水化合物[21]。白蛋白-葡聚糖共价结合物并包载阿霉素,整个制备过程在全水相环境中进行,得到呈球形、单分散182 nm载药纳米粒子,药物包埋量和包埋效率可达到30%和90%以上,能够有效抑制肿瘤的增长以及延长小鼠的存活寿命[22]。化学接枝多糖可赋予蛋白质及其自组装更加丰富的特性,如壳聚糖具有pH敏感性,壳聚糖的引入可改善蛋白质-壳聚糖自组装体pH的敏感性,为环境响应性自组装体的制备提供多种可能性。

5 蛋白质-无机纳米自组装

磁性-蛋白质自组装中,四氧化三铁(Fe304)是被研究得最多的一种磁性粒子。如Peng等证实Fe3O4磁性纳米粒子对溶菌酶在很宽pH范围内有良好的吸附性,特别是在其等电点时有最大吸附量[23]。蛋白质也常与其它贵金属发生自组装行为,Liu等巧用酪蛋白的自组装行为,用胶束来稳定金纳米离子,研究酪蛋白浓度及pH对金纳米离子粒径的影响,并研究其仿生催化的行为[24]。Lee则利用微波法制备溶菌酶/金纳米材料并对其进行表征,发现能较好的降低细胞毒性,并讨论其机制[25]。溶菌酶对金的稳定性具有较好的稳定效果,低温下储藏一个月仍然具有较好的稳定性,有趣的是纳米金-溶菌酶溶液在室温条件下放置一个星期,可形成均一的微米管结构,该微管是由于溶菌酶分子相互氢键作用连接而成[26]。蛋白质丰富的活性基团可其与无机纳米材料的自组装提供各种便利,如氨基、羧基、巯基等,蛋白质-无机纳米自组装不仅可改善无机材料的生物毒性,也可把无机材料光学、电学、热学及成像等特性赋予其自组装体,从而实现自组装体的多功能化。

6 蛋白质自组装体的应用

6.1 载送体系

蛋白质自组装体在药物及营养素载送方面展现了极大的应用前景,受到广泛关注。聚乙二醇修饰的白蛋白纳米粒子比单独白蛋白纳米粒子有更好的稳定性,还能降低血浆蛋白的吸附[27]。溶菌酶与果胶通过自组装形成纳米凝胶具有良好的生物相容性和pH响应性,对癌细胞的增殖抑制作用较游离氨甲喋呤明显增强,对HepG2细胞具有更高的细胞毒性,可促进细胞凋亡,增强抗癌活性[28]。其次,利用蛋白质自组装行为可对功能性成分进行增溶、保护及递送,包括类胡萝卜素、脂肪酸、甾醇等。特别是对外界环境较为敏感的活性成分,不仅起到增溶的作用,还能抵抗保存、加工过程中不良环境对其活性成分的破坏,研究较多有姜黄素、叶酸等[29]。

6.2 治疗肿瘤

蛋白质纳米除了可以载抗肿瘤药物,抑制肿瘤细胞的生长,还能对肿瘤做早期诊断,通过磁性材料及叶酸的修饰,可实现对肿瘤细胞靶向治疗作用。如傅晓源等制备荧光量子点标记的叶酸偶联白蛋白纳米粒,实现该纳米粒对人结肠癌细胞的靶向性,直观的证实了叶酸修饰的白蛋白/量子点纳米颗粒能通过细胞膜上的叶酸受体内吞入细胞,可显著靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞[30]。肿瘤组织内的血管会发生一些变异,纳米颗粒可被动靶向到肿瘤组织,以通过扩散和流动由高渗透性的肿瘤血管外渗到肿瘤间隙,达到肿瘤成像的目的[31]。另外用糖类、叶酸、转铁蛋白、亲和素等材料修饰纳米颗粒,依据不同修饰特性可实现主动靶向治疗肿瘤的目的。

6.3 传感器

纳米材料具备优异的物理、化学、电催化等性能,加之其量子尺寸效应和表面效应,可将传感器的性能提高到一个新的水平。利用自组装技术和静电吸附作用,将带壳聚糖及葡萄糖氧化酶组装于L-半胱氨酸修饰的金电极表面,用于葡萄糖的检测,不仅增强了灵敏度,还降低了检测下限[32]。利用生物识别自组装方法能很好地保持分子的原有形态。金胶体标记人血清蛋白,然后将其固定在硅片上,单层金纳米颗粒标记的蛋白分子复合体可提高了复合体的表面覆盖度,同时提供了一种研究蛋白分子的表面增强拉曼散射活性基底[33]。

7 展望

蛋白质是一类具有独特三维空间结构的生物高分子,其分子内部非共价键协同作用是形成三维空间结构的重要驱动力。蛋白质和高分子化合物结构的复杂性使它们在溶液状态下的构象变化、分子重排规律尚不明确,因此研究它们之间的非共价键作用难度较大,不确定性因素较多。对于多种自组装体系而言,种类之多,结构之复杂,目前未有统一的规律性。从动力学和热力学的角度研究高分子与蛋白质混合体系自组装行为及多糖与蛋白质形成的自组装体的机理尚不明确,如何人为有效控制纳米材料的物理、化学性质,如粒径大小、稳定性、抗消化性、载药能力等,均是食源性蛋白质需要克服的难题。

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Self-assembly of foodborne protein and their applications

XU Wei1,2,ZHAO Xin-mei1,2,YUAN Hong-yu1,2,LI Pei-yi1,LUO Deng-lin3,LI Ying-ying1

(1. College of Life Science,Xinyang Normal University,Xinyang 464000,China;2. Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains,Xinyang 464000,China;3. College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)

Protein self-assembly plays a much more important role in food and material field due to its natural advantage,non-toxic,better biodegradable and good biocompatibility. In this paper,we introduced several common protein self-assembly forms,including common protein self-assembly,protein-protein self-assembly,protein-polysaccharide self-assembly,protein glycosylation self-assembly,and protein inorganic self-assembly nanometer materials. Finally,the application of the protein self-assembly was briefly introduced.

protein;self-assembly;nanogel;application

2016-07-29

许威 (1986-)，男，博士，讲师，研究方向：食品大分子互作及配料稳态化，E-mail：toxuwei1986@163.com。

信阳师范学院青年科学基金(16050)；国家自然科学基金面上项目(31371832)。

TS201

A

:1002-0306(2017)03-0386-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.068