丙型肝炎病毒蛋白对肝细胞RASSF2 mRNA表达的影响及其机制

2017-03-31陈炜冯德云李波王颖

中国普通外科杂志 2017年5期

陈炜，冯德云，李波，王颖

（中南大学湘雅医院病理科，湖南长沙 410008）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是肝细胞癌发生的重要诱因之一，据统计，全世界有2亿多人感染了HCV病毒，约占了世界人口的3.3%。HCV蛋白受宿主和病毒蛋白酶的作用被切割形成至少10种蛋白，包括4种结构蛋白（核心蛋白Core、包膜蛋白E1和E2，还有p7离子通道）和6种非结构蛋白（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。随着对肿瘤发病机制认识的深入，表观遗传学改变在肿瘤发生中的作用已日渐受到重视。DNA甲基化是表观遗传学的重要表现形式，是调节基因组功能的重要手段，RASSF2通过启动子甲基化在多种肿瘤中失活[1-7]。它作为一种潜在的抑癌基因，具有促进凋亡和细胞周期停滞及抑制细胞生长的作用[8-9]。RASSF2有3个转录本，分别为RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C，仅RASSF2A转录本的启动子区有CpG岛。研究表明，RASSF2A以GTP依赖的方式与K-RAS直接结合，促进细胞凋亡、细胞周期停滞和抑制细胞生长[8]，在肺癌、胃癌、乳腺癌及胰腺癌中存在RASSF2A启动子甲基化[1,10-11]。5-杂氮-2'-脱氧胞苷（5-aza-dC）是一种核苷酸类似物，可抑制甲基化转移酶的活性，使DNA去甲基化，体外实验表明，5-aza-dC对胰腺癌、鼻咽癌、胃癌及结肠癌等多种细胞有显著生长抑制作用[12-15]，推测HCV蛋白可能是通过诱导RASSF2A基因启动子甲基化，抑制其转录，从而异常激活RAS信号通路，参与肝细胞恶性转化。本研究观察了分别表达NS3、Core、NS5A的QSG7701肝细胞株（NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701）中RASSF2 mRNA表达水平的改变，并探讨RASSF2A启动子甲基化在HCV蛋白所致的肝细胞癌中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

稳定表达Core、NS3的人源肝细胞系Core/QSG7701和NS3/QSG7701由本实验室构建及保存；稳定表达NS5A的人源肝细胞系NS5A/QSG7701由中南大学湘雅二医院传染科龚国忠教授惠赠；其中L02细胞株购自中南大学细胞生物学研究室；RT-PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、逆转录试剂盒均购自TaKaRa公司；EZDNA甲基化修饰试剂盒购自天漠科技有限公司；5-aza-dC购自Sigma公司；NS3、NS5A、β-Actin单克隆抗体以及Core多克隆抗体均购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和羊抗鼠均购自中杉金桥；AnnexinV/PI双染试剂盒购自联科生物；细胞增殖与毒性检测试剂盒购自七海复泰。RASSF2基因的PCR引物由上海生物工程有限公司合成（正义：CTA TGG CTC TGT CAC CAA CG，反义：GCT TCT GTT TCT CAC CAC TCG，长度128 bp），GAPDH引物（正义：GTG AAC CAT GAG AAG TAT GAC AAC，反义：CAT GAG TCC TTC CAC GA TAC C，长度123 bp）；RASSF2A启动子甲基化引物（正义：GTT CGT CGT CGT TTT TTA GGC G，反义：AAA AAC CAA CGA CCC CCG CG，长度108 bp），RASSF2A启动子未甲基化引物（正义：AGT TTG TTG TTG TTT TTT AGG TGG，反义：AAA AAA CCA ACA ACC CCC ACA，长度108 bp）。

1.2 主要方法

1.2.1 RT-PCR 按照细胞中提取RNA的步骤所示取出生长良好的细胞，用PBS清洗3次，1 mL的TRIzol试剂吹打，200 μL的三氯甲烷孵育5 min，500 μL的异丙醇孵育10 min，75%的乙醇吹打混匀，离心后静置干燥5 min。加入10 μL的DEPC水，吹打混匀，取2 μL RNA样本，紫外分光光度计检测RNA样本的浓度和纯度，再根据TAKARA公司的逆转录试剂盒所示配制基因组DNA去除的反应液，共 10 μL，反应条件为 42 ℃ 2 min，4 ℃存放。配制20 μL的逆转录反应液，反应条件为37 ℃15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃存放，根据康维世纪PCR试剂盒进行扩增，扩增条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，72 ℃终延伸2 min，共35个循环，扩增结束后取出样本，配制好2%的琼脂糖凝胶，直接进行电泳。

1.2.2 甲基化特异性PCR（MSP）细胞培养好后取出，胰酶消化后，用1 mL的PBS吹打，离心后加入200 μL的PBS重悬细胞，根据TAKARA公司的全基因组DNA提取试剂盒所示，最终洗脱DNA，再取20 μL DNA按照天漠公司的甲基化修饰试剂盒所示加入CT Conversion Reagent，放到PCR仪上，设置程序为98 ℃ 10min，64 ℃ 2.5 h，接着继续按试剂盒所示最终洗脱DNA，按照康维世纪盒所示配制50 μL PCR扩增反应液，设置反应条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃终延伸2 min，共35个循环，扩增后取反应产物，配制好2%的琼脂糖凝胶后，进行电泳。

1.2.3 Western blot 首先按步骤提取细胞中的总蛋白，准备4 ℃离心机，用冰的PBS洗涤3次，每瓶细胞中加入100 μL的细胞裂解混合物，冰上裂解30 min，离心后得到蛋白，用BCA法测定样本OD值，每管加入25 μL的标准品和200 μL已配制好的工作液，37 ℃孵育30 min，568 nm处测定OD值。然后每管加入22.5 μL的双蒸水、2.5 μL的待测蛋白及200 μL的分析液，37 ℃孵育30 min，测OD值计算蛋白浓度，再按比例将蛋白与上样缓冲液混合，沸水5 min，按步骤配好分离胶和积层胶后，将Maker、混合物和上样缓冲液加入到凝胶孔中，连接电泳装置，65 V电压50 min，110 V电压60 min，完毕后取出凝胶，配制好转膜缓冲液，并加入甲醇，将凝胶和滤纸直接放入到转膜缓冲液中，PDVF膜甲醇浸泡15 s，双蒸水平衡5 min，放到转膜缓冲液里。安装三明治结构，从下到上依次为滤纸→PVDF膜→凝胶→滤纸。15 V恒压45 min。配制好封闭液，PVDF膜放到封闭液中，摇晃4 h。接着一抗孵育（摇床2 h，4 ℃冰箱过夜），TBST洗涤3次，每次10 min，二抗孵育4 h，TBST洗涤3次，每次10 min。打开显像仪，设置曝光程序为每5s曝光1次，共曝100张。

1.2.4 MTT 待细胞生长良好后，PBS洗3次，胰酶消化吹打细胞并计数。每孔加入2 500个细胞，设置5个复孔，且每株细胞分别为对照组和实验组，培养箱中培养24、48、72 h后，避光加入20 μL（5 mg/mL）的MTT试剂，继续培养4 h。加入150 μL的DMSO，摇晃20 min后，酶标仪490 nm处测其OD值。

1.2.5 流式细胞术取生长良好的细胞，胰酶消化后分组，再加入不同浓度药物，贴壁生长后用预冷PBS洗涤3次，并重悬。再按照试剂盒所示加入相应试剂，上机前加入10 μL的PI，避光孵育10 min。加入400 μL的1×结合缓冲液，上机并记录结果。

1.3 统计学处理

采用PASW Statistics 18软件进行统计分析，实验数据用均数±标准差（±s）表示，计量资料组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701细胞中相应蛋白表达

提取分别转染空载体pRcCMV、NS3、NS5A和Core表达质粒的QSG7701细胞的总蛋白，检测NS3、Core、NS5A蛋白的表达，结果显示转染了NS3、NS5A和Core表达质粒的细胞均有相应蛋白的表达（图1）。

图1 NS3、Core、NS5A蛋白检测Figure1 Detection of expressions of NS3, Core and NS5A proteins

2.2 L02、Core/QSG7701、NS3/QSG7701及 NS5A/QSG7701细胞中RASSF2 mRNA表达

提取L02、Core/QSG7701、NS3/QSG7701及NS5A/QSG7701细胞的总RNA，检测每株细胞RASSF2 mRNA的相对表达量，与L02细胞（RASSF2 mRNA表达量：0.582±0.066）比较，Core/QSG7701（RASSF2 mRNA表达量：0.027±0.004）、NS3/QSG7701（RASSF2 mRNA表达量：0.146±0.074）及NS5A/QSG7701（表达水平0.094±0.014）3株细胞的RASSF2 mRNA的表达均明显降低（P=0.000、0.002、0.000）（图2）。

图2 RASSF2 mRNA表达检测Figure 2 Detection of RASSF2 mRNA expressions

2.3 RASSF2A启动子甲基化检测

提取NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701细胞的DNA，进行甲基化的修饰，检测该3株细胞系的RASSF2A启动子的甲基化状态，显示3株细胞RASSF2A启动子均发生了完全甲基化（图3）。

图3 MSP结果 M：甲基化特异性扩增；U：非甲基化特异性扩增Figure 3 Results of MSP M: Methylated-specific methylation;B: Unmethylated-specific methylation

2.4 5-aza-dC处理对各细胞RASSF2 mRNA表达的影响

每株细胞设置3组，分别为未加药物的对照组、5 μmol/L 5-aza-dC实验组和10 μmol/L 5-azadC实验组，培养4 d，检测各组细胞RASSF2 mRNA的表达。结果示：NS3/QSG7701细胞株中，与对照组比较，5 μmol/L 5-aza-dC实验组和10 μmol/L 5-aza-dC实验组RASSF2 mRNA的表达明显增多（P=0.000、0.000）；Core/QSG7701细胞株中，与对照组比较，5 μmol/L 5-aza-dC实验组和10 μmol/L 5-aza-dC实验组RASSF2 mRNA的表达明显增多（P=0.023、0.000）；NS5A/QSG7701细胞中，与对照组比较，5 μmol/L 5-aza-dC实验组和10 μmol/L 5-aza-dC实验组RASSF2 mRNA的表达无明显变化（P=0.170、0.270）（图4）。

2.5 5-aza-dC处理对NS3/QSG7701和Core/QSG7701细胞生物学行为的影响

将NS3/QSG7701和Core/QSG7701细胞分为未加药物的对照组和10 μmol/L 5-aza-dC处理的实验组，NS3/QSG7701细胞株对照组与实验组凋亡率分别为（11.68±1.05）%、（27.60±1.57）%，差异有统计学意义（P=0.000）；Core/QSG7701细胞株对照组与实验组凋亡率分别为（20.38±1.62）%、（56.79±1.92）%，差异有统计学意义（P=0.000）（图5）。同时，于10 μmol/L 5-aza-dC处理0、24、48、72 h后检测细胞的增殖，与对照组比较，NS3/QSG7701细胞72 h后，细胞的增殖明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）；Core/QSG7701细胞24、48、72 h时间点，细胞的增殖均明显受到抑制，差异有统计学意义（均P＜0.05）（表2）。

图4 5-aza-dC处理后各细胞RASSF2 mRNA的表达 A：NS3/QSG7701细胞；B：Core/QSG7701细胞；C：NS5A/QSG7701细胞Figure 4 RASSF2 mRNA expressions in each type of cells after 5-aza-dC treatment A: NS3/QSG7701 cells; B: Core/QSG7701 cells;C: NS5A/QSG7701 cells

图5 流式细胞术检测细胞凋亡Figure 5 Cell apoptosis detected by flow cytometry

表1 5-aza-dC处理对NS3/QSG7701细胞增殖的影响（OD，±s）Table 1 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in NS3/QSG7701 cells (OD,±s)

注：1)与0 h比较Note: 1) Comparison with 0-h value

时间对照组实验组 P1)0 h 0.09±0.008 0.09±0.008 —24 h 0.453±0.029 0.375±0.045 0.065 48 h 1.260±0.108 1.116±0.003 0.082 72 h 1.458±0.028 1.273±0.017 0.010

3 讨论

HCV基因组大约有9.6 kb，编码约含3 000个氨基酸的多聚蛋白，能被病毒或宿主细胞的酶剪切成至少10种结构蛋白和非结构蛋白，这些蛋白在病毒的复制和致病过程中起着重要作用[16]。研究[17]表明，表达HCV相关蛋白的质粒转染至正常肝细胞后，能促进肝细胞无限增殖，并导致其恶性转化。DNA甲基化是表观遗传学中最常见的现象，约60%的人类基因启动子区含有CpG岛。CpG岛甲基化使染色体结构发生变化，高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性，从而导致转录抑制。目前发现启动子高甲基化的基因有Rb、P16INK4a、VHL、hMLH，这些启动子基因的高甲基化与细胞周期、凋亡、DNA的修复以及血管生成有关[18-21]。有研究[22-24]显示抑癌基因RASSF2A基因失活最重要的机制是由于其启动子发生了甲基化，在结肠癌的细胞系、结肠腺瘤以及结肠癌中常见RASSF2A启动子甲基化，而正常的结肠黏膜则否。

表2 5-aza-dC处理对Core/QSG7701细胞增殖的影响（OD，±s）Table 2 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in Core/QSG7701 cells (OD，±s)

注：1)与0 h比较Note: 1) Comparison with 0-h value

时间对照组实验组 P1)0 h 0.09±0.008 0.09±0.008 —24 h 0.394±0.005 0.354±0.012 0.006 48 h 1.150±0.017 0.999±0.028 0.001 72 h 1.417±0.058 1.136±0.029 0.002

既往研究[25]表明表观遗传学的变化是可逆的，DNA甲基转移酶的抑制剂可以改变DNA启动子甲基化的状态，使其发生去甲基化，5-aza-dC是一种DNA甲基转移酶抑制剂，当DNA复制时，它可结合到5-甲基胞嘧啶的位置，使DNA甲基转移酶失活，达到去甲基化的作用，使甲基化的抑癌基因重新活化，抑制细胞生长或促进细胞凋亡。5-aza-dC除了能够诱导DNA去甲基化，还可以使组蛋白去甲基化，它还可还原甲基化或乙酰化所诱导的染色质重塑[26]。在基因转录沉默过程中，组蛋白乙酰化和DNA甲基化之间相互作用，启动子CpG岛的甲基化使局部的组蛋白去乙酰化，组蛋白乙酰化保护DNA不发生甲基化[27]。

本研究检测了正常肝细胞L02和NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701细胞系中RASSF2 mRNA的表达，结果显示，与正常的肝细胞L02相比，NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701细胞的RASSF2 mRNA的表达均下降，表明NS3、Core和NS5A蛋白能抑制RASSF2 mRNA的表达；MSP检测该3株细胞系中RASSF2A基因启动子甲基化的状态，发现RASSF2A基因启动子均发生了完全甲基化。为了进一步分析RASSF2 mRNA的表达的下降是否与RASSF2A启动子的高甲基化有关，用不同浓度的去甲基化药物5-aza-dC处理了NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701细胞，结果发现5-aza-dC处理后，NS3/QSG7701和Core/QSG7701细胞RASSF2 mRNA的表达明显升高，而NS5A/QSG7701细胞RASSF2 mRNA的表达没有明显改变。这说明HCVNS3和Core可能通过RASSF2A启动子甲基化，发挥其转录抑制作用，而NS5A/QSG7701细胞RASSF2 mRNA表达降低，可能除了启动子甲基化外，还有其他表观遗传学修饰参与了转录沉默。

细胞增殖和细胞凋亡是反映细胞生物学行为的主要指标之一，有研究[28-31]证实同为RASSF家族的RASSF5作为RAS效应因子，连接RAS与HIPPO信号通路，在调控蛋白的稳定性和促进衰老的过程中发挥着重要作用，抑癌基因RASSF2A很可能是通过与K-Ras相互作用发挥其促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的功能[32]，本研究结果显示，10 μmol/L 5-aza-dC处理NS3/QSG7701和Core/QSG7701细胞后，能抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，表明HCVNS3和Core可能是通过促进RASSF2A启动子甲基化导致其表达下调，从而在HCV致癌过程中通过影响肝细胞的生物学行为参与肝细胞癌的发生。

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