双参口服液的研制及其抗氧化作用的研究①

马丽文，宋琳琳，胡晓艳，胡晓冬，骆宇鑫，张 洁

(佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

双参口服液的研制及其抗氧化作用的研究①

马丽文，宋琳琳，胡晓艳，胡晓冬，骆宇鑫，张 洁

(佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：探讨研制双参口服液的最佳制备工艺及多糖含量测定，并研究多糖体外抗氧化性。方法：用正交试验法进行制备工艺的研究，并对双参口服液的多糖进行含量测定以及体外抗氧化性的研究。结果：双参口服液研制的最佳超声提取工艺为：样品比例为2:1:2(玉竹:沙参:党参)，超声时间为50min，超声温度为60℃时，多糖的提取率最高。用苯酚-浓硫酸法测定样品多糖的平均含量为15.90%。在体外抗氧化活性实验中，双参口服液中的多糖在一定浓度范围内对DPPH自由基和·OH自由基有清除能力。结论：双参口服液中的多糖采用超声波提取法是可行的并且含量较高，双参口服液中的多糖具有很好的体外抗氧化活性。

双参口服液；多糖；超声提取；抗氧化活性

双参口服液是由玉竹、沙参、党参配伍而成，玉竹为百合科黄精属植物玉竹(Polygonatumodoratum(Mill)Druce)的干燥根茎，该植物含有各种丰富的甾体皂苷[1]、多糖、氨基酸等化学成分，是一种生理活性显著且极具开发利用价值的植物资源。多糖在玉竹中含量较高，玉竹多糖具有抗氧化[2]、强心、降血脂、降血糖等作用。党参(CodonopsispilosulaFranchNannf)为多年生草本植物，属桔梗科，药用干燥根。党参主要成分为多糖、黄酮以及生物碱等成分。党参多糖化合物在党参中具有很强的生物活性，党参多糖能起到降低血压、降低血糖血脂、抗衰老[3]、抗肿瘤[4]等多种作用。沙参(AdenophorastrictaMiq)多年生草本植物，属桔梗科。北沙参的化学成分主要包括多糖、香豆素类、三萜酸、氨基酸等成分。沙参多糖具有祛痰作用、抗真菌作用、强心作用。现代药理学研究表明自由基与许多疾病的发生、恶化以及有机体的衰老过程密切相关[5]。本研究以玉竹、党参、沙参为原料，对它们的活性多糖成分进行超声提取[6～8]，在此基础上研发出双参口服液，该产品的研发对促进中药产业的发展具有积极作用。

1 实验材料

1.1 药材来源

玉竹、沙参、党参等药材购于黑龙江省佳木斯市药店。

1.2 材料

仪器：KDM电加热套(山东省甄诚环宇科研仪器厂)；RE-52A旋转蒸发器(西安汇鸿环保科技有限公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TJ82-3电动离心沉淀机(北京京立离心机有限公司)；FA2004电子分析天平(徐州彭宇电子仪器有限公司)；UV-757紫外可见分光光度计(北京谱析通用)；试剂：化学试剂均为分析纯；无水乙醇(北京化工厂)；浓硫酸(北京化工厂)；葡萄糖标准品(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；水杨酸(广州温联化工有限公司)；DPPH(北京豪尔科技有限公司)。

2 方法

2.1 双参口服液的研制

为优化提取工艺条件，制定正交实验方案，本实验采取三因素三水平的正交实验，以确定最佳工艺条件，选用因素及水平见表1。按照所选取的比例称取三种药材共90g，将药材浸泡12h后，进行超声提取，过滤，共提取2次，将2次滤液合并，滤液移至500mL烧杯中，将其浓缩到原来体积的三分之一，冷却，加入200mL95% 的乙醇溶液，边加边搅拌，然后静置12h，之后将上层滤液倒入回收瓶里以备回收。将下层沉淀中残余的乙醇挥发掉，然后将沉淀放在烘箱中105℃烘干。精密称量干燥的样品。见表1。

多糖提取率(%)=多糖PoPs(mg)/样品质量(mg)×100%。

表1 正交实验影响因素水平表

2.2 双参口服液多糖的含量测定

2.2.1 葡萄糖标准品溶液的制备

精密称取无水葡萄糖10mg，加蒸馏水溶解后并定容至100mL容量瓶中，摇匀，即配制得0.1mg·mL-1的葡萄糖标准品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的样品10mg，加水溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀。

2.2.3 标准曲线的绘制

精密吸取上述葡萄糖标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分别放置于10mL干燥的具塞试管中，加入蒸馏水至2.0mL，摇匀。再分别加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速加入5mL浓硫酸，摇匀，微振5min。放置5min后，置于沸水浴中加热15min，然后取出，冷却至室温(25℃)。另外取一只10mL的具塞试管，以蒸馏水2.0mL按如上同样操作后作为空白对照，于最大吸收波长处(490nm)测定吸光度。同一浓度标准溶液分别重复测定3次,取平均值。以葡萄糖浓度(μg·mL-1)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3 双参口服液中多糖含量的测定

精密称取各批次供试品液2.0mL，按照“标准曲线的绘制”项下的自“加5%苯酚溶液”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中多糖的浓度。

多糖的含量(%)=(C样×100/10000)×100% (C样为标准曲线上查得的样品浓度)

2.3.1 对·OH自由基清除作用

[9],取1.0mL0.15mol·mL-1pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，1.0mL40μg·mL-1番红花红溶液，0.945mmol·mL-1EDTA-Fe(Ⅱ)(新配)溶液1.0mL，0.5mL不同浓度的双参口服液多糖溶液、3%H2O2溶液1.0mL(新配)，在37℃水浴中加热30min后在520nm处测定吸光度A样。空白组以0.5mL水代替样品测定吸光度A0。对照组以1.5mL蒸馏水代替H2O2和样品测定吸光度A，用3.5mL蒸馏水代替番红花红、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2、样品，并和1.0mL磷酸盐缓冲溶液进行调零。清除率%=(A样-A0)/(A-A0)×100%。

2.3.2 对DPPH·的清除能力

样品与抗氧化剂预期作用模式为AH+DPPH·→DPPH-H+A，准确称取10mgDPPH，用50%乙醇定容至250mL容量瓶中，配得0.1mmol/L的DPPH溶液。见表2。

表2 DPPH·实验加样表

样品对DPPH·自由基的清除能力(scavengingactivity，SA)可表示公式为

SA(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%

3 结果

3.1 双参口服液的最佳制备工艺

见表3。

表3 双参口服液正交实验提取结果

对上表进行直观分析可知，极差大小显示各因素的影响作用依次为A>C>B，即样品之间的比例>超声温度>超声时间。双参口服液研制的最佳超声提取工艺为A3B3C2，即最佳提取工艺为样品比例2:1:2，超声温度为60℃，超声时间为50min。

3.2 双参口服液多糖的含量测定

3.2.1 葡萄糖标准曲线

见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

在490nm处测定吸光度A值。横坐标为葡萄糖浓度(C)，纵坐标为吸光度(A)，绘制标准曲线，得到回归线方程为y=0.0102x+0.088，R2=0.9932。

3.2.2 双参口服液中多糖的含量测定

见表4。

表4 双参口服液多糖的含量测定(n=9)

经计算，求得供试品中多糖的平均含量为15.9%。

3.3 双参口服液的体外抗氧化性研究

3.3.1 对·OH自由基清除作用

取不同浓度的双参口服液中的多糖溶液测定其多糖对·OH的清除作用。

由图2所知，不同浓度的双参口服液中的多糖对·OH具有一定的清除作用，其清除能力呈现出剂量依赖性，即双参口服液中多糖浓度越大，对羟自由基的清除率越大。样品在5～17.5mg·mL-1时，双参口服液中的多糖清除羟自由基能力迅速提高，当样品浓度达到17.5mg/mL以后，清除羟自由基能力上升缓慢。各个样品在试验浓度范围内呈现良好的量效关系。见图2。

图2 双参口服液对·OH的清除能力

3.3.2 对DPPH·的清除能力

取不同浓度的双参口服液中的多糖溶液测定其多糖对DPPH·的清除作用。见图3。

图3 双参口服液对DPPH·的清除能力

不同浓度的双参口服液多糖提取物样品清除DPPH自由基的能力如图3所示。当样品达到一定浓度时所有样品的DPPH自由基清除能力均提高迅速，之后增长趋势趋于缓慢，它们的DPPH自由基清除能力呈剂量依赖性，随着浓度的逐渐增加其自由基清除能力逐渐增强。

4 讨论

双参口服液是由玉竹、沙参、党参配伍而成， 采用超声等工艺提取，配制而成的中药复方制剂口服

液，具有降血压、降血脂之功效，为了使产品的质量得以保证，本论文采用正交实验法，系统地考察了样品之间的比例、超声温度、以及超声时间对口服液多糖提取率的影响，并用苯酚硫酸法测定多糖的含量，摸索出制备工艺的最佳条件为样品比例为2:1:2(玉竹:沙参:党参)，超声时间为50min，超声温度为60℃时，多糖的提取率最高。双参口服液提取物多糖对清除·OH自由基、DPPH·自由基均有一定的量效关系，而且双参口服液多糖在一定浓度范围内清除·OH、DPPH·自由基效果随双参口服液提取物多糖浓度的增加而加强。

综上所述，双参口服液多糖的提取采用超声波提取法，工艺合理，含量较高，并且双参口服液提取物多糖对清除·OH自由基、DPPH·自由基均有一定的量效关系，将作为一种抗氧化新药为人类的健康作出贡献。

参考文献

[1]宋琳琳,佟丽华. 冬奇子口服液的研制及质量标准的研究[J]. 黑龙江医药科学, 2009,32(3):22-23

[2]宁慧,李会宁,杨培君,等. 玉竹多糖的抗氧化作用研究[J]. 陕西理工学院学报(自然科学版), 2013, 29(26):59-65

[3]宋琳琳,李怀荆. 冬奇子口服液抗衰老的实验研究[J]. 黑龙江医药科学, 2010,33(6): 24-25

[4]杨瑾, 刘杰书, 袁德培. 板桥党参多糖体内抗肿瘤活性实验研究[J]. 中国处方药, 2014,12(3): 25-26

[6]JiH,ShaoH,ZhangC,etal.SeparationofthepolysaccharidesinCaulerparacemosaandtheirchemicalcompositionandantitumoractivity[J].JournalofAppliedPolymerScience, 2008, 110(3):1435-1440

[7]谢建军, 胡蔓菁, 孙桂菊,等. 玉竹多糖提取工艺的优化[J]. 江苏中医药, 2009, 41(10): 59-60

[8]YEChunlin,JIANGChengjun.OptimizationofextractionprocessofcrudepolysaccharidesfromPlantagoasiaticaLbyresponsesurfacemethodology[J].CarbohydratePolymers, 2011, 84(1):495-502

[9]贝玉祥, 郭英, 范逸平,等. 诃子多酚清除活性氧自由基及体外抗氧化作用研究[J]. 云南民族大学学报自然科学版, 2009, 18(1):51-54

Preparation of ShuangShen oral liquid and studies on its antioxidant effect

MALi-wen,SONGLin-lin,HUXiao-yan,HUXiao-dong,LUOYu-xin,ZHANGJie

(School of Pharmacological Sciences, Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To explore the optimum ultrasonic extraction techniques for ShuangShen oral liquid and the determination of polysaccharide, and to study the antioxidant activity of polysaccharideactivity in vitro. Methods: The orthogonal experiment was used to study the extractive techniques, and to observe the influence of the ratio between samples, ultraphonic time and ultraphonic temperature on the extractive efficiency of polysaccharide. The contents of extraction of polysaccharide were determined by phenol-sulfuric acid method. The study of polysaccharide activity in vitro was used to observe the scavenging activity of ·OH and DPPH·. Results: The optimum extraction technology of ShuangShen oral liquid is that the ratio between samples was 2:1:2 (polygonatumodoratum: adenophora: codonopsis pilosula); the ultrasonic temperature was 60℃; and ultrasonic time was for 50min. The ratio of extraction of polysaccharide was at the highest levels. The determination of polysaccharides content of the sample determined by phenol-sulfuric acid method was 15.90%. In the experiment of antioxidant activity in vitro, the polysaccharide of ShuangShen oral liquid in a certain concentration range could remove ·OH and DPPH. Conclusion: The polysaccharide of ShuangShen oral liquid extracted by ultrasonic method is feasible. The determination of polysaccharide content by phenol-sulfuric acid method is accurate and reliable. The polysaccharide in ShuangShen oral liquid has the ability to remove ·OH and DPPH· , and the scavenging capacity is proportional to the concentration. And it has good antioxidant activity.

ShuangShen oral liquid; polysaccharide; ultrasonic extraction; antioxidative activity

1.国家自然科学基金，编号：21271089；2.黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：201510222036；3.佳木斯大学科学技术研究项目，编号：13Z1201561。

马丽文(1995～)女，黑龙江哈尔滨人，在读本科学生。

宋琳琳(1982～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，讲师。E-mail：linlin19822891@163.com。

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A

1008-0104(2017)01-0006-03

2016-12-10)