齐墩果酸对急性髓系白血病鼠cav-1基因表达的影响①

杨 玉，侯 玥，吴天琪，冯 靖，王迪迪，张鹏霞，于 莲

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007；2.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯154007； 3佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯154007)

齐墩果酸对急性髓系白血病鼠cav-1基因表达的影响①

杨 玉1，侯 玥2，吴天琪2，冯 靖2，王迪迪1，张鹏霞1，于 莲3

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007；2.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯154007； 3佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯154007)

目的：本研究通过体内实验探讨齐墩果酸(oleanolic acid，OA)对急性髓系白血病的治疗作用及其对膜蛋白cav-1表达的影响。方法：通过尾静脉注射HL-60细胞于SCID小鼠制备动物模型，并于3周后给予OA治疗。在此期间，观察一般情况变化，并计数白细胞。RT-PCR法分析cav-1mRNA表达。结果：白血病移植模型小鼠使用OA治疗后生存时间延长、体重增加、白细胞数量降低，cav-1mRNA表达增加。结论：OA可缓解急性髓系白血病病情进展的疗效，其作用可能与增加cav-1基因表达有关。

齐墩果酸；cavelin-1；急性髓系白血病

窖蛋白-1(cavelin-1，cav-1)是胞膜窖的主要组成成分，并广泛参与各种细胞信号通路，与癌症的发生发展密切相关[1]。本课题组前期研究证实，cav-1在白血病HL-60细胞中表达下降，其在急性髓系白血病中扮演抑癌基因的角色[2～4]。在白血病动物模型中, cav-1的作用尚未得到证实。本实验通过制备白血病移植瘤模型，并以经体外研究证实具有抑制HL-60细胞增殖作用的药物齐墩果酸予以干预[5]。检测各组移植模型鼠的cav-1基因表达情况，探讨cav-1在白血病发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

重症联合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency mice，SCID)购自北京维通利华实验技术有限公司[合格证明编号：SCXX(京)2007-0001]，急性早幼粒细胞系细胞株HL-60购买于中科院上海生命科学院。齐墩果酸从中国药品生物制品检定所购买。RT-PCR试剂盒及引物合成服务均由Takara公司提供。实验室常规传代培养HL-60细胞。

1.2 实验动物饲养及分组

体重(15±2)g的雌性SICD鼠30只，饲养于SPF级实验室。实验设正常对照组、模型对照组与OA干预组，随机每组分配10只小鼠。

1.3 动物模型制备及药物干预

模型组与干预组动物连续两天经腹腔注射环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)3mg/d/只。第3天取对数生长期HL-60细胞，以RPMI-1640培养基重悬并调整细胞浓度至2×107/mL，取0.5mL细胞悬液尾静脉注射动物。造模第21d，干预组鼠皮下注射OA，剂量200mg/kg；模型组鼠经皮下注射等量2% Tween-80，连续给药14d。观察小鼠的精神状态、体重变化、生存时间等一般情况。

1.4 白细胞计数

第3、5周，各组小鼠取血20μL加入0.38mL稀释液底部，混匀至呈褐色，10倍镜下计数。

1.5 RT-PCR检测cav-1mRNA的表达

造模第36天，眼后静脉丛法获得各组小鼠外周血，分离并收集白细胞，Trizol法提取总RNA。RT-PCR按试剂盒说明书操作，产物大小362bp。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠一般情况检查

2.1.1 成瘤情况与全身状况：接种HL-60细胞3周后，SCID小鼠可见腹部膨胀，解剖腹腔可见瘤块。结合在25d左右观察到小鼠出现精神萎靡、食欲降低、可触摸到肝脾肿大等全身状况的改变，说明成功建立白血病移植瘤模型。

2.1.2 体重改变与存活时间：OA治疗2周后，小鼠体重与模型组比较明显增加(P<0.05)，并且与2周前比较小鼠体重没有明显下降(P>0.05)，见表2。OA干预组小鼠存活时间(55.8±7.6)d与模型组鼠存活时间(41.1±4.8)d相比明显延长(P<0.01)。

表2 各组小鼠体重情况±s，g)

2.2 白细胞计数结果

造模第3、5周检测，模型组动物白细胞随时间延长而明显增高(P<0.05)，OA干预组动物白细胞未见明显升高(P>0.05)。第5周，干预组动物白细胞数量与模型组相比明显降低，但仍未恢复至正常水平，各组间比较具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠白细胞计数结果

2.3 外周血白细胞cav-1mRNA表达水平

与模型组比较，OA干预组动物的cav-1mRNA表达水平增加，见图1。

图1 外周血白细胞cav-1mRNA表达水平

注：M：Marker；N：正常组；OA：OA干预组；C：模型对照组

3 讨论

SCID鼠是经典模式生物，由位于第16号染色体的scid基因突变所致。SCID鼠表现为严重缺乏功能成熟的T、B细胞，但是其仍保留有一定的免疫防御功能，如其NK细胞功能并未受损[6]。基于此，本实验在接种前经腹腔注射环磷酰胺清除NK细胞，以保障移植瘤的正常生长。从成瘤情况、体重改变、全身状况等都说明我们成功的建立了急性髓系白血病SCID移植模型鼠[5]。

OA是五环三萜类化合物，无明显毒副作用。天然及合成的OA能调节多条信号通路，具有强的抗肿瘤与抗血管生成活性[7]。基于早期治疗的原则，我们于能观察到瘤块形成的造模第3周开始OA干预治疗。从体重改变、存活时间与白细胞计数方面的结果来看，OA确实具有抗白血病的疗效，该结果也与我们在体外实验得到的结果相一致。cav-1的mRNA表达水平在模型鼠中是降低的，OA干预后随着白血病移植模型鼠症状的缓解，cav-1的水平升高。cav-1作用具有复杂性，可以通过多个信号通路调控肿瘤的发生与进展。在不同白细胞肿瘤细胞中，其表达亦有所不同，如在成人T细胞白血病中即表达增加[8]。从实验结果分析，我们推测cav-1在急性髓系白血病移植模型鼠中可能扮演着抑癌基因的角色，但是我们尚无法确定在OA的干预下的病情缓解与cav-1水平升高之间的因果关系，也就是说cav-1的表达水平也可能是随着病情缓解而有所恢复的。在后续实验中，我们将从信号通路与肿瘤细胞凋亡的角度，进一步研究OA对急性髓系白血病的干预机制及其与cav-1表达改变的关联。

[1]何其勇,付先东, 国麟棋. 肝再生过程中胆汁酸对caveolin-1表达的影响[J].黑龙江医药科学，2013，36(3): 85-86

[2]马微，李丽，杨永旭，等.Cav-1基因在五种白血病细胞中的表达[J].中国老年学杂志，2013,33(19)：4754-4756

[3]WeiMa,Di-DiWang,Peng-XiaZhang.Caveolin-1playsakeyroleinOleanolicacid-inducedapoptosisofHL-60cells[J].OncologyReports, 2014, 32(1):293-301

[4]王迪迪，马微，葛堂栋，等.齐墩果酸对白血病HL-60细胞PI3K、Akt、Cav-1表达的影响[J].黑龙江医药科学，2013，36(6):1-2

[5]DewanMZ,TerunumaH,AhmedS,etal.NaturalkillercellsinbreastcancercellgrowthandmetastasisinSCIDmice[J].BiomedPharmacother,2005, 59(Suppl2): 375-379

[6]杨颖，蔡玟，黄志彪，等. 环磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型建立与评价[J]. 中国公共卫生，2008，24(5)：581-582

[7]ShanmugamMK,DaiX,KumarAP,etal.Oleanolicacidanditssyntheticderivativesforthepreventionandtherapyofcancer:preclinicalandclinicalevidence[J].CancerLett, 2014, 346(2):206-216

[8]马微，王迪迪，王昭，等. 慢病毒介导的cav-1过表达对HL-60细胞增殖与凋亡的影响[J]. 中国实验血液学杂志，2013：21(4)：905-910

1.国家自然科学基金面上项目，编号：81274101；81070428;2.佳木斯大学校级交叉学科研究项目，编号：jc2014-001；3.佳木斯大学创新团队，编号：cxtd-2016-03；4.国家级大学生创新创业训练计划项目，编号：201510222002；5.省级大学生创新创业训练计划项目，编号：201410222027，201410222047。

杨玉(1982～)女，黑龙江宝清人，硕士，讲师。

张鹏霞(1967～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，博士研究生导师。E-mail:pengxiaz@163.com。

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1008-0104(2017)01-0001-02

2016-09-20)