北方四省区番茄褪绿病毒的分子鉴定

王翠琳, 冯 佳, 孙晓辉, 王少立, 赵 静, 刘金亮, 竺晓平*

(1. 山东农业大学植物保护学院, 泰安 271018; 2. 潍坊科技学院蔬菜研究所,寿光 262700; 3. 吉林大学农学部植物科学学院, 长春 130062)

北方四省区番茄褪绿病毒的分子鉴定

王翠琳1, 冯 佳1, 孙晓辉1, 王少立1, 赵 静2, 刘金亮3, 竺晓平1*

(1. 山东农业大学植物保护学院, 泰安 271018; 2. 潍坊科技学院蔬菜研究所,寿光 262700; 3. 吉林大学农学部植物科学学院, 长春 130062)

2015-2016年间,在山西省、内蒙古自治区、辽宁省、吉林省采集到疑似感染番茄褪绿病毒Tomatochlorosisvirus(ToCV)的番茄植株。利用扩增ToCV外壳蛋白(coat protein,CP)和类热激蛋白(heat shock protein 70 homolog,HSP70h)基因片段的两对特异性引物,通过RT-PCR对疑似样品进行分子检测,得到970 bp和1 864 bp的特异条带,经测序、比对确定为ToCV。序列分析表明,山西晋中分离物SXJZ (KX853540)的CP核苷酸序列与河南安阳分离物HNAYHX (KP264983)相似性为99.7%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT (KU204709)和辽宁大连分离物LNDL (KU204707)的CP核苷酸序列与国内已报道的山东寿光分离物SDSG (KC709510)相似性分别为99.5%和99.7%,吉林长春分离物JLCC (KU306111)的CP核苷酸序列与山东聊城分离物SDLC (KC812622)的相似性为99.8%。而HSP70h核苷酸序列的相似性分析表明,山西晋中分离物SXJZ (KX853539)与日本分离物Tochigi (AB513442)相似性为99.4%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT (KU204710)、辽宁大连分离物LNDL (KU204708)和吉林长春分离物JLCC (KX880384)与山东寿光分离物SDSG (KC709510)相似性分别为99.7%、99.8%和99.7%。试验结果明确了番茄褪绿病毒已蔓延传播到我国山西、内蒙古及东北地区。

番茄褪绿病毒;CP;HSP70h; RT-PCR

番茄褪绿病毒Tomatochlorosisvirus(ToCV)属于长线形病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus,基因组包含两条正义单链RNA。ToCV通过粉虱以半持久方式传毒,不能通过汁液摩擦传毒。ToCV能够侵染的寄主主要为茄科Solanaceae、夹竹桃科Apocynaceae、番杏科Aizoaceae、菊科Asteraceae、藜科Chenopodiaceae、蓝雪科Plumbaginaceae等科的作物和杂草[1],其中,番茄是其最重要的寄主,感染ToCV的番茄植株,叶片表现为脉间褪绿变黄、叶脉深绿,随后叶片变厚、变脆且易折,严重时整株死亡。该病毒于1998年在美国的佛罗里达州首次被报道[2],随后在意大利、以色列、法国、墨西哥、古巴、巴西、土耳其、日本及苏丹等国家相继被发现[3-10]。在我国,最早于2004年在台湾地区发现,于2013年后在北京、江苏、山东、河北、天津、河南等地区陆续有关于ToCV的报道[11-19]。

近年来,由于工厂化种苗调运和交流频繁,设施中烟粉虱发生严重,北京、江苏、山东、山西、陕西、浙江及内蒙古地区设施栽培中均检测到了粉虱携带ToCV,且粉虱带毒率逐年增加[12-13,20],促进了ToCV在全国范围内蔓延发展,局部地区已经暴发流行,给番茄产业造成了严重威胁[14,21-22]。虽然在山西、内蒙古等地检测到粉虱携带ToCV,但目前ToCV在山西、内蒙古以及东北地区番茄寄主上的发生情况尚不明确,因此,本研究针对山西、内蒙古、辽宁、吉林四省、区番茄种植区采集到的疑似ToCV症状的番茄样品,进行分子检测和鉴定,并将上述地区ToCV分离物与国内外ToCV分离物构建系统进化树,分析其亲缘关系,以明确ToCV在上述地区的发生情况,为其发生、危害提供预警和防治措施。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

2015年7月在内蒙古、辽宁和吉林三省区番茄种植区采集到疑似感染ToCV的番茄样本共79份,其中在内蒙古自治区呼和浩特市采集到1份,辽宁省锦州市、大连市、灯塔市分别采集13、10、14份,吉林省长春市、松原市分别采集28、13份。2016年8月在山西、内蒙古地区番茄种植区采集到疑似感染ToCV番茄样本44份,其中在内蒙古呼和浩特市采集3份、赤峰市12份,山西省晋中市29份。将采集到的样品冻于-80℃冰箱中保存,以备后续试验使用。

1.1.2 菌株和载体

Escherichiacoli菌株(DH5α)由本实验室保存;PMD18-T克隆载体购于宝生物工程(TaKaRa)有限公司。

1.1.3 生化和分子生物学试剂

RNA提取试剂TransZol、TaqDNA聚合酶、dNTPs、分子量标准Trans2K Plus DNA Marker购于北京全式金生物技术有限公司;凝胶回收试剂盒购于天根生物技术有限公司;反转录试剂RNase M-MLV(RNase H-)、RNase Inhibitor购于宝生物工程(TaKaRa)有限公司,其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国内分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片总RNA的提取及病毒基因扩增

称取寄主植物叶片0.1 g,加液氮研磨至粉末,按照TransZol法提取叶片总RNA,用于cDNA的合成。反转录体系:模板RNA 3.0 μL,下游引物1.0 μL,RNase-free dH2O 2.0 μL,70℃变性10 min,迅速放于冰上2 min,再加入下列试剂:5×M-MLV buffer 2.0 μL,dNTPs mixture (10 mmol/L) 0.5 μL,RTase M-MLV (RNase H-) (200 U/μL) 0.5 μL,RNase inhibitor (40 U/μL) 0.25 μL,RNase free dH2O 0.75 μL,总体积为10 μL。42℃保温60 min,再70℃保温15 min。病毒检测采用本实验室设计的ToCV特异性引物ToCV-CP-F(5′-CCTCAAAGAGCTAAACTGGAC-3′)/ToCV-CP-R(5′-CACATCACCGGAACCCAAAGTCAC-3′) (扩增片段对应RNA2的4 241～5 210 nt,包含了长度为774 bp的ToCV完整CP及其上下游一段序列)和To-HSP-F(5′-GTCGACAATAATTAGCGGTCC-3′)/To-HSP-R(5′-TTATTACTAATGGGCCGGACTC-3′) (扩增片段对应RNA2的637～2 500 nt,序列包含了长度为1 665 bp的ToCV完整HSP70h及其上下游一段序列)。PCR扩增条件:预变性94℃ 3 min;变性94℃ 30 s,退火(ToCV-CP-F/ToCV-CP-R 52℃,ToCV-HSP-F/ToCV-HSP-R 53℃)30 s,延伸72℃(ToCV-CP-F/ToCV-CP-R 1 min,ToCV-HSP-F/ToCV-HSP-R 1 min 40 s),共30个循环;终延伸72℃ 10 min。

取20 μL PCR扩增产物与2.5 μL 6×Loading buffer混合并于1%的琼脂糖凝胶上检测并拍照记录。参照试剂盒说明回收目的条带并与pMD18-T过夜连接,转化DH5α,挑取单斑37℃过夜培养,阳性克隆经检测后,交由上海铂尚生物科技有限公司测序。

1.2.2 序列分析

利用NCBI中BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对所得分离物的扩增序列进行分析比对,分别选取NCBI上已发表的ToCV代表性分离物的CP和HSP70h序列,对所选定的序列利用DNAStar中的MegAlign软件进行同源性比对,利用软件Mega 5.05 的Clustal W法进行多序列比对分析以及邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统进化树,系统进化树中各分支置信度(bootstrap)进行1 000次重复分析。所选用的序列信息见表1。

表1 用于序列比较和进化分析的病毒序列信息

Table 1 Sequences information of virus used for sequence

comparison and phylogenetic analysis

登录号Accessionnumber分离物名称Isolate分离地点LocationDQ136146(CP&HSP70h)AT80/99西班牙FJ542305(CP&HSP70h)TiCV-SP5131西班牙JQ952601(CP&HSP70h)ToC-Br2巴西KP137101(CP&HSP70h)JJ韩国KC709510(CP&HSP70h)SDSG中国KJ815045(CP&HSP70h)Nanjing中国AB513443(CP)Tochigi日本AY903448(CP)Florida美国DQ234673(CP)IS以色列EU625350(CP)Fr法国HG380090(CP)To-Il2010希腊KC311375(CP)BJ中国KC812622(CP)SDLC中国KP217199(CP)HBLF中国KP264983(CP)HNAYHX中国KU204707(CP)LNDL中国KU204709(CP)NMHHHT中国KU306111(CP)JLCC中国KP246844(CP)Tianjin中国KR150986(CP)Zhengzhou中国KX853540(CP)SXJZ中国AB513442(HSP70h)Tochigi日本EU284744(HSP70h)Gr-535希腊KC812626(HSP70h)SDLC中国KC887999(HSP70h)ToCV-BJ中国KU204710(HSP70h)NMHHHT中国KU204708(HSP70h)LNDL中国KP217198(HSP70h)HBSJZ中国KP217202(HSP70h)HBLF中国KP264986(HSP70h)HNAYHX中国KP893120(HSP70h)Tianjin中国KX853539(HSP70h)SXJZ中国KX880384(HSP70h)JLCC中国NC_007341(HSP70h)Florida美国

2 结果与分析

2.1 ToCVCP和HSP70h基因的扩增

2.1.1 ToCV分离物CP基因的扩增

利用ToCV特异性引物ToCV-CP-F/ToCV-CP-R对采集的样品进行PCR扩增,仅在山西省晋中市榆次区乌金山镇南胡、内蒙古呼和浩特市赛罕区、辽宁省大连市瓦房店元台镇、吉林省长春市蔬菜花卉研究所的4份样品中扩增得到大小约为970 bp的特异性条带(图1a),经测序比对,4条序列与NCBI上已登录的ToCV序列相似性均达99%以上,确定了山西晋中分离物SXJZ (KX853540)、内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT (KU204709)、辽宁大连分离物LNDL (KU204707)、吉林长春分离物JLCC (KU306111)为ToCV。

2.1.2 ToCV分离物HSP70h基因的扩增

如上所述,对采集的山西、内蒙古、辽宁和吉林的样品进一步用ToCVHSP70h特异性引物ToCV-HSP-F/ToCV-HSP-R进行PCR扩增,得到了大小约为1.8 kb(测序确定为1.864 kb)的特异性条带(图1b),经测序比对,进一步确定了山西晋中分离物SXJZ (KX853539)、内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT (KU204710)、辽宁大连分离物LNDL (KU204708)、吉林长春分离物JLCC (KX880384)为ToCV。

2.2 序列分析

将本试验得到的分离物序列与GenBank中登录的其他代表地区性分离物以及同属于毛形病毒属的番茄侵染性褪绿病毒Tomatoinfectiouschlorosisvirus(TiCV)的CP和HSP70h核苷酸序列通过DNAStar中的MegAlign软件进行相似性比对。SXJZ、NMHHHT、LNDL、JLCC分离物的CP核苷酸序列与中国其他地区分离物、日本分离物Tochigi (AB513443)、美国分离物Florida (AY903448)相似性均在99%以上。SXJZ分离物的CP核苷酸序列与河南安阳分离物HNAYHX (KP264983)相似性最高,为99.7%；NMHHHT、LNDL分离物的CP核苷酸序列与山东寿光分离物SDSG (KC709510)相似性最高,达99.5%和99.7%；JLCC分离物的CP核苷酸序列与山东聊城分离物SDLC (GKC812622)相似性最高,为99.8%。4个分离物与同属的TiCV (FJ542305)CP核苷酸序列相似性均低于50%。HSP70h核苷酸序列比对结果表明,SXJZ分离物与日本分离物Tochigi (AB513442)相似性最高,为99.4%；NMHHHT、LNDL、JLCC分离物HSP70h核苷酸序列与山东寿光分离物SDSG (KC709510)相似性最高,分别为99.7%、99.8%和99.7%,与中国其他地区分离物相似性均为90%以上,而与TiCV(FJ542305)HSP70h核苷酸序列相似性在65%以下。

图1 ToCV CP和HSP70h基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results with primers for CP and HSP70h of ToCV

为明确各地区分离物的进化关系和分类地位,选取NCBI上已登录的世界各地代表分离物的CP和HSP70h核苷酸序列进行系统进化树分析(图2)。由CP和HSP70h的系统进化树可以看出SXJZ分离物、NMHHHT分离物、LNDL分离物、JLCC分离物与日本分离物、中国其他地区分离物同处于一个大的分支上,与日本及中国其他地区分离物亲缘关系较近。

图2 ToCV CP和HSP70h系统进化树Fig.2 Phylogenetic relationships of ToCV CP and HSP70h

3 结论与讨论

番茄是我国最重要的蔬菜之一,也是一种重要的经济作物。随着种植面积的扩大,病害种类也增多,病毒病已成为仅次于真菌病害的第二大病害[23],是影响番茄产量的重要限制因素。番茄褪绿病毒是近几年发生的一种新传入的病毒,该病毒引起的症状初期不明显,难辨认,随后出现的症状与营养素缺乏、物理损伤或者农药药害相似[21],在病害调查中难以通过肉眼观察判断,需进行更为准确的分子生物学检测、电子显微镜观察或血清学方法确定其发生情况,故常延误其最佳防治时期,这也一定程度上加重了该病害的发生、流行。除了侵染番茄,该病毒还能侵染甜椒、马铃薯、茄子等蔬菜[24-26]。温室白粉虱、纹翅粉虱、Q型烟粉虱和B型烟粉虱都可以传播ToCV。粉虱食性杂,在多种杂草作物上常见[27],在温室栽培条件下可周年发生,粉虱一旦携带了ToCV,设施作物更易受到ToCV的侵染,极有可能导致ToCV大面积流行暴发[24]。在田间ToCV常与另一种由烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒Tomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV)发生复合侵染[28],对番茄生产造成更严重的损失。

本研究利用ToCV的两对特异性引物在山西晋中、内蒙古呼和浩特、辽宁大连、吉林长春4个地区的番茄样品上分别检测出ToCV,通过序列一致性分析和系统进化树构建,从四省、区获得的4个分离物与中国山东、北京等地区分离物相似性最高,亲缘关系最近,因此推测其传播来源有关联性,可能是由于地区间种苗调运导致ToCV传播。检测鉴定结果表明ToCV已蔓延发展到我国的山西、内蒙古及东北地区。山西省ToCV检出率为3.45%,辽宁省检出率为2.70%,吉林省检出率为2.44%,内蒙古地区两年的检出率为6.25%,四省、区番茄植株上ToCV的检出率低,表明该病害在北方四省、区处于病害流行的始发阶段,还未对番茄生产造成明显损失,但该病害流行速度快,传播范围广,潜在风险高,应引起相关部门的重视。建议有关部门加强对地区间调运种苗的检测,积极采取防治措施,同时相关科研部门积极寻找抗病品种资源、研究防控措施,以防止该病害在山西、内蒙古、辽宁、吉林四省、区大规模流行暴发。

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(责任编辑:杨明丽)

Molecular identification ofTomatochlorosisvirusfrom four provinces or autonomous region in northern China

Wang Cuilin1, Feng Jia1, Sun Xiaohui1, Wang Shaoli1, Zhao Jing2, Liu Jinliang3, Zhu Xiaoping1

(1.CollegeofPlantProtection,ShandongAgricultureUniversity,Tai’an271018,China;2.VegetableResearchInstituteofWeifangUniversityofScienceandTechnology,Shouguang262700,China;3.CollegeofPlantSciences,AgriculturalDivision,JilinUniversity,Changchun130062,China)

During 2015 and 2016, tomato plant samples with symptoms similar toTomatochlorosisvirus(ToCV) infection were collected from field in Shanxi, Liaoning, Jilin provinces and Inner Mongolia Autonomous Region. The specific primers for coat protein gene (CP)and heat shock protein 70 homolog (HSP70h) gene of ToCV were applied to perform RT-PCR detection. Two specific fragments with length of 970 bp and 1 864 bp respectively, were obtained and sequenced. BLAST results confirmed the presence of ToCV in these samples. The similarity analysis showed that the nucleotide sequence ofCPfrom the isolate SXJZ (KX853540) shared 99.7% sequence identity with reported isolate HNAYHX (KP264983, Anyang, Henan); the isolate NMHHHT (KU204709, Hohhot,Inner Mongolia)and LNDL (KU204707, Dalian, Liaoning) shared 99.5% and 99.7% sequence identity with reported isolate SDSG (KC709510, Shouguang, Shandong), respectively. And the nucleotide sequence ofCPof the isolate JLCC (KU306111, Changchun, Jilin) shared 99.8% sequence identity with isolate SDLC (KC812622, Liaocheng, Shandong). As forHSP70h, the nucleotide sequence ofHSP70hfrom the isolate SXJZ (KX853539, Jinzhong, Shanxi) shared 99.4% sequence identity with isolate Tochigi (AB513442, Japan). And the isolate NMHHHT (KU204710), isolate LNDL (KU204708)and isolate JLCC (KX880384) shared 99.7%, 99.8% and 99.7% nucleotide sequence identity with isolate SDSG (KC709510), respectively. These results confirmed that the ToCV has spreaded to the Shanxi, the Inner Mongolia and the northeast of China.

Tomatochlorosisvirus;CP;HSP70h; RT-PCR

2016-03-14

2016-09-29

山东省科技发展计划项目(2014GNC111008)；山东省自然科学基金(ZR2015CQ022)

S 432.412

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.024

* 通信作者 E-mail: zhuxp@sdau.edu.cn