蒙氏假单胞菌3A菌株对烟草漂浮育苗中TMV的钝化效果

2017-03-29袁莲莲王耀锋刘相甫靳志伟董石飞赵存孝黄明迪王凤龙杨金广

植物保护 2017年2期

袁莲莲, 王耀锋, 刘相甫, 靳志伟, 张静, 李伟,董石飞, 赵存孝, 黄明迪, 王凤龙, 杨金广*

(1.中国农业科学院烟草研究所,国家烟草行业烟草病虫害监测与综合治理重点开放实验室, 青岛 266101;2. 甘肃省烟草公司庆阳市公司, 庆阳 745000; 3. 中国烟叶公司, 北京 100055; 4. 甘肃省烟草公司, 兰州 741306;5. 红云红河烟草(集团)有限责任公司, 昆明 650231; 6. 甘肃省烟草公司陇南市公司, 陇南 746000)

袁莲莲1, 王耀锋2, 刘相甫3, 靳志伟4, 张静5, 李伟5,董石飞5, 赵存孝2, 黄明迪6, 王凤龙1, 杨金广1*

选用对烟草花叶病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)具有显著拮抗活性的蒙氏假单胞菌Pseudomonasmonteilii3A菌株对烟草漂浮育苗过程中被TMV污染的育苗棚、育苗盘、基质及剪叶机械等进行生物钝化,并利用real-time RT-PCR对污染基质中TMV的含量进行了定量检测。结果显示,200、400倍及600倍P.monteilii3A菌悬液稀释液均可显著钝化病苗残留干叶及干根中的TMV;剪叶机械经不同稀释倍数的P.monteilii3A菌悬液处理后,在一定程度上抑制了TMV的发生,相对防效达51.42%～100%;基质经不同稀释倍数的P.monteilii3A菌悬液处理后,其中TMV的含量也下降了72.73%～88.46%,对TMV的相对防效达61.56%～87.46%。其中,200倍P.monteilii3A稀释液处理育苗棚、育苗盘20 min以上,浸泡剪叶机械1 min以上对TMV钝化效果最好。

烟草普通花叶病毒(TMV); 蒙氏假单胞菌3A菌株; 漂浮育苗

烟草花叶病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)引起的病毒病可严重危害农作物的正常生长。TMV在农作物上主要通过农事操作进行传播,烟草育苗过程中被TMV污染的育苗棚、育苗盘、基质及剪叶机械等是TMV的重要初侵染源[1]。由于TMV拥有较高的侵染稀释限点,极微量的病毒粒体就可以传播,且TMV的抗逆性较强,其病毒粒体在基质中残留10年仍具有较强的侵染活性[2-3];此外,生产上常用的育苗盘一般多孔,不易进行清洗和消毒,且经常会有一些烟苗残体黏附在苗盘上,TMV可在干的烟苗残体中存活数年[4];再者,烟草育苗期需进行多次剪叶,且育苗集中度高,一旦存在毒源则容易大面积传播[5]。为了能够更有效地控制TMV侵染带来的危害,应从根本上减少其初侵染源,切断其传播途径[6]。近些年,实际生产中主要通过喷施抗病毒药剂对TMV进行防治,但效果并不理想,且存在着严重的农药残留问题,导致农作物和环境被严重污染。1925年,有研究发现被细菌污染的植物病毒提取液丧失了侵染能力,这为利用微生物及其代谢产物防治植物病毒病提供了新的思路[7]。微生物农药为无公害生物制剂,具有安全可靠、对环境友好等优点,应用其防治TMV可避免环境污染和农药残留[8]。因此,筛选有效、安全的生物制剂对烟草育苗过程中TMV的防控具有重要意义。

研究者曾对育苗过程中剪叶机械的消毒剂进行了筛选[9-11],分析了蒸汽、部分药剂对旧漂浮盘残留物中TMV的钝化效果[11-12],但少有喷施有效的生物制剂钝化育苗棚、育苗盘中病苗残留物(根、叶)、基质及剪叶机械中TMV的研究报道,而生物制剂如能同时用于育苗棚、苗盘、基质及剪叶机械等钝化TMV,在实际生产上将更为经济方便。结合实际生产情况,本研究选用对TMV具有较强拮抗活性的蒙氏假单胞菌Pseudomonasmonteilii3A菌液喷施于育苗棚、剪叶机械、基质及育苗盘,比较几种常用浓度菌液钝化TMV的效果,以期为烟草育苗过程中钝化TMV的生物制剂的选择和科学使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草品种为‘NC89’,在中国农业科学院烟草研究所试验基地培育至4～6叶期健康烟苗供试。TMV毒源系及P.monteilii3A菌株均由中国农业科学院烟草研究所分离纯化和鉴定,TMV经过枯斑寄主三生烟单斑分离3次后接种于‘NC89’幼苗上,于25～28℃防虫条件下保存备用,P.monteilii3A在-70℃条件下于甘油中保存。抗TMV药剂对照为8%宁南霉素水剂,由德强生物股份有限公司提供。

1.2 蒙氏假单胞菌3A菌液对TMV体外抑制效果测定

将甘油中保存的P.monteilii3A菌株,在LB固体培养基上画线培养,挑取单菌落接种于3 mL LB液体培养基中,于28℃扩大培养48 h,取纯化好的菌株涂片,进行革兰氏染色及运动力检测。纯化好的菌株进行生理生化测定,经菌株鉴定为P.monteilii3A后,以1∶100比例接种于LB液体培养基中,进行大规模发酵培养,最后用无菌水稀释成1×108cfu/mL作为菌液备用。

利用局部枯斑法测定P.monteilii3A菌液对TMV的抑制效果[13]。称取2 g新鲜TMV病叶加100 mL 灭菌磷酸缓冲液研磨成匀浆,用灭菌纱布过滤后取上清液作为接种液;P.monteilii3A菌液用无菌水稀释200、400倍和600倍。分别将不同浓度的3A菌液稀释液与TMV接种液等量混合,室温下分别静置10、20 min后摩擦接种,接种前叶片表面喷洒适量金刚砂。左半叶接种磷酸缓冲液处理的TMV接种液(对照),右半叶接种P.monteilii3A菌液与TMV接种液的混合液,每半片叶接种200 μL。接种后用清水进行叶面冲洗,3次重复。接种3 d左右后进行枯斑数统计,并计算抑制率。

抑制率(%)=[1-(处理平均枯斑数/对照平均枯斑数)]×100。

1.3 病苗残留干叶、干根的蒙氏假单胞菌3A菌液浸泡处理

选用稀释200、400、600倍的P.monteilii3A菌液来模拟旧育苗盘、育苗棚的处理。将感染TMV的烟苗的细干根及干叶放置于烧杯中,分别加入20倍材料体积的不同稀释倍数的菌液浸泡20 min,倒去菌液,用塑料薄膜密封烧杯口,室温下放置2 d,随后加入20倍材料体积的去离子水研磨,过滤后取上清液进行接种;以LB液体培养液浸泡感病组织作为对照。采用局部枯斑法测定,接种3 d后统计枯斑数。

1.4 蒙氏假单胞菌3A菌液对TMV污染剪叶机械的浸泡处理

取新鲜TMV病叶3～5片,用剪刀反复多次剪切病叶,然后将感染TMV的剪刀分别在稀释200、400、600倍的P.monteilii3A菌液中浸泡10 s、1 min和5 min,清水冲洗后剪叶,另设清水对照。每个处理6株烟苗,每株剪3片烟叶,重复3次,剪叶后每个处理分开单独培养。30 d后统计发病率、病情指数。

发病率(%)=100×发病株数/调查总株数;

病情指数=100×(∑各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值);

控制效果(%)=100×(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数。

1.5 蒙氏假单胞菌3A菌液对TMV污染基质中TMV的钝化效果

10 g 新鲜TMV病叶加100 mL 磷酸缓冲液研磨成匀浆,按照1∶5 (mL/g)比例浇灌基质。然后用不同浓度的3A菌液分别按照1∶5 (mL/g)比例处理病毒汁液浇灌过的基质,室温静置15 d,以此基质种植4叶期‘NC89’幼苗。以0.16 μg/mL宁南霉素水剂按照1∶5(mL/g)比例处理病毒汁液浇灌过的基质为药剂对照,无菌水处理为空白对照。30 d后统计发病率、病情指数,并再采集各处理的基质利用real-time RT-PCR测定其TMV相对含量。

1.6 Real-time RT-PCR

采集被TMV污染的基质,依据McGrath等的方法进行离心处理[14],后利用PowerSoilTM RNA Extraction Kit (MoBio, USA)进行总RNA提取,提取方法参照试剂和说明书进行操作,每个样品进行3次重复提取。

参考试剂盒说明书合成cDNA,利用PerlPrimer软件设计TMV的特异性引物,引物由宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)合成,烟草内参基因qActinF:5′-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3′;qActinR:5′-AAGGGATGCGAGGATGGA-3′;qTMV5:5′-ATTAGACCCGCTAGTCACAGCAC-3′,qTMV3:5′-GTGGGGTTCGCCTGATTTT-3′[15]。根据SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect real time)的说明书设定PCR反应体系及条件,设置5个cDNA浓度梯度,10、102、103、104、105,每个梯度各3次重复,利用 ABI 7500 Real-Time PCR system (ABI,USA)自带的SDS软件进行数据分析,生成标准曲线方程。同时,通过Real-Time PCR检测TMV基因的积累量[16]。

1.7 数据分析

所得数据均用Excel 2010软件处理,同时利用SPSS(version 14.0)统计软件中单样本t-test对不同处理的差异显著性进行分析。

2 结果分析

2.1 蒙氏假单胞菌3A菌液对新鲜病叶中TMV的防控作用

不同稀释倍数的P.monteilii3A菌液与TMV接种液等量混合并分别静置10 min、20 min后接种‘NC89’,以测试P.monteilii3A对TMV的钝化效果。从表1中可看出,P.monteilii3A菌液稀释液对TMV的抑制率与混合后静置的时间呈正相关,混合液静置10 min后进行接种,其200、400、600倍稀释液对TMV的抑制率分别为100.00%、76.34%、72.68%;混合液静置20 min后接种,对TMV的抑制率分别为100.00%、82.77%、77.43%,表明P.monteilii3A菌液可显著钝化新鲜病叶中的TMV,钝化效率高达72.68%～100.00%,对TMV的钝化效果随混合液静置时间的延长而增强,但均随菌液浓度的降低而下降,采用200倍P.monteilii3A菌液,与TMV接种液的接触时间不少于10 min时抑制效果最佳。

2.2 蒙氏假单胞菌3A菌株对病苗残留干叶、干根中TMV的钝化作用

选用稀释200、400、600倍的P.monteilii3A菌液浸泡感染TMV的烟苗残留干叶及干根后接种健康烟苗测定P.monteilii3A菌液对TMV的钝化作用。结果表明,以LB液体培养基浸泡后的感病组织作为毒源接种健康烟苗,接种叶片上出现较多枯斑,而经不同倍数P.monteilii3A菌液浸泡后的感病组织浸提液接种的叶片枯斑数量较少或者没有。表明不同浓度的P.monteilii3A菌液均可显著钝化病苗残留干叶及干根中的TMV,200倍P.monteilii3A菌液的钝化效果最佳。

表1 不同浓度蒙氏假单胞菌3A菌液对新鲜病叶中TMV的钝化效果

Table 1 Prevention effects ofPseudomonasmonteilii3A bacterial liquid on TMV in fresh tobacco diseased leaves

处理Treatment稀释倍数/倍Dilutionmultiple接触10min的枯斑数/个No.oflocalnecroticlesionsaftercontactfor10min对照CK处理Treatment抑制率/%Inhibitionrate接触20min的枯斑数/个No.oflocalnecroticlesionsaftercontactfor20min对照CK处理Treatment抑制率/%Inhibitionrate蒙氏假单胞菌P.monteilii3A20055.300100.0077.300100.0040035.508.4076.3438.306.6082.77600142.4038.9072.68133.8030.2077.43

图1 不同稀释倍数的蒙氏假单胞菌3A菌株菌悬液对TMV的钝化作用Fig.1 Passivation of Pseudomonas monteilii 3A on TMV at different concentrations of bacterial suspension

2.3 蒙氏假单胞菌3A菌株对被污染剪叶机械上TMV的钝化效果

表2列出了蒙氏假单胞菌3A菌株对被污染剪刀中TMV的钝化效果。从表中可看出,剪刀经清水浸泡处理的对照,TMV发病率为34%左右,而剪刀经过不同稀释倍数的P.monteilii3A菌悬液处理后,在一定程度上抑制了烟草普通花叶病的发生,相对防效达51.42%～100%。随着P.monteilii3A菌悬液处理浓度升高,或处理时间延长,TMV发病率显著下降,防治效果明显增加。剪刀经稀释200倍的P.monteilii3A菌悬液浸泡不少于1 min时对TMV的钝化效果最好,防治效果达100%。

表2 蒙氏假单胞菌3A菌株对污染剪刀中TMV的钝化效果1)

Table 2 Passivation effect ofPseudomonasmonteilii3A on TMV in clipping tools

处理Treatment稀释倍数/倍Dilutionmultiple发病率/%Diseaseincidence10s1min5min相对防效/%Relativecontroleffect10s1min5min蒙氏假单胞菌P.monteilii3A200(7.28±0.04)dA(0.00±0.00)dB(0.00±0.00)dB(77.30±0.07)aB(100.00±0.00)aA(100.00±0.00)aA400(11.24±0.03)cA(5.59±0.07)cB(1.24±0.04)cC(65.43±0.03)bC(86.34±0.02)bB(91.32±0.10)bA600(18.34±0.10)bA(11.56±0.09)bB(4.64±0.09)bC(51.42±0.12)cC(65.24±0.11)cB(88.05±0.12)cA无菌水Sterilewater0(34.24±0.17)aA(34.65±0.10)aA(34.42±0.22)aA---

1) 同行数据后具有不同大写字母者表示在0.05水平差异显著;同列数据后具有不同小写字母者表示在0.05水平差异显著。 The data in the same row followed by different capital letters are significantly different (P<0.05); the data in the same column followed by different lowercase letters are significantly different (P<0.05).

2.4 蒙氏假单胞菌3A菌株对TMV污染的植烟土壤中TMV的钝化效果

经AB7500 Real-time PCR system自带的SDS软件分析Real-time PCR检测所得的数据,可生成TMV和Actin基因的标准曲线,经稀释10～1055个梯度处理的cDNA起始模板量和循环阈值Ct的线性关系曲线。TMV基因的标准曲线方程:y=-3.867 5x+33.5,R2=0.996 0;Actin的标准曲线方程:y=-2.402 1x+30.931,R2=0.9972。R2均达0.98以上,熔解曲线峰单一,无非特异性扩增,定量准确,符合实时荧光定量PCR要求。

表3显示了蒙氏假单胞菌3A菌株对TMV污染基质中TMV的钝化效果。可看出,与无菌水处理相比,经不同稀释倍数P.monteilii3A菌悬液处理后,基质中TMV的含量显著降低,TMV的发病率也显著下降,相对防效达61.56%～87.46%。随着P.monteilii3A菌悬液浓度的升高,TMV发病率显著下降,防治效果明显增强,其中,400倍P.monteilii3A菌悬液处理对基质中TMV的钝化效果与宁南霉素相近,相对防效在75%左右。处理后基质中TMV的含量下降了72.73%～88.46%,表明P.monteilii3A菌悬液可明显减少植烟基质中TMV的含量。200倍P.monteilii3A菌悬液对TMV的钝化作用最佳。

表3 蒙氏假单胞菌3A菌株对基质中TMV的钝化作用1)

Table 3 Passivation effect ofPseudomonasmonteilii3A on TMV in matrix

处理Treatment发病率/%Diseaseincidence相对防效/%Relativecontroleffect基质中TMV拷贝数/个·g-1AmountofTMVinmatrix1∶200P.monteilii3A(7.08±0.01)d(87.46±0.04)a(2864.02±5.02)d1∶400P.monteilii3A(16.26±0.04)c(76.59±0.09)b(4573.12±7.13)c1∶600P.monteilii3A(28.68±0.07)b(61.56±0.08)c(6747.34±8.03)b宁南霉素(阳性对照)Ningnanmycin(positivecontrol)(17.33±0.02)c(74.46±0.14)b(4457.26±7.52)c无菌水(空白对照)Sterilewater(negativecontrol)(53.24±0.10)a-(24745.64±10.82)a

1) 基质中TMV拷贝数为6个采样点的平均值;同列数据后具有不同小写字母者表示在0.05水平差异显著。 The TMV copies in matrix are means of six sampling sites. The data in the same column followed by different lowercase letters are significantly different (P<0.05).

3 讨论与结论

烟草生产过程中易受到多种病毒的危害,比较不同病毒的体外保毒期、钝化温度、稀释限点及传播方式等可看出,TMV抗逆性最强、最易通过育苗过程传播,且烟苗一旦被TMV侵染,则无法进行有效防治[5]。因此,本研究测定生防菌株蒙氏假单胞菌3A菌株对烟草漂浮育苗中TMV的钝化效果,通过消灭初侵染源和切断传播途径来进行防治,同时,对生产上利用生物制剂防治烟草漂浮育苗过程中其他病毒具有指导意义。

本研究选用对TMV具有显著拮抗活性的生防菌株蒙氏假单胞菌3A菌株,对烟草漂浮育苗过程中被TMV污染的育苗棚、育苗盘、基质及剪叶机械等进行生物钝化,并利用real-time RT-PCR对污染基质中TMV的含量进行了定量检测。结果显示,不同倍数P.monteilii3A菌悬液均可显著钝化感病烟苗残留干叶及干根中的TMV;剪叶机械经不同稀释倍数的P.monteilii3A菌液处理后,在一定程度上可抑制TMV的发生,相对防效达51.42%～100%;基质经不同稀释倍数的P.monteilii3A菌液处理后,其中TMV的含量也下降了72.73%～88.46%,对TMV的相对防效61.56%～87.46%。总体来说,P.monteilii3A对烟草漂浮育苗中TMV的钝化效果显著。

本研究中使用的TMV浓度较高,在实际生产上剪叶机械、苗盘、基质和人为操作等的带毒浓度远比试验浓度低,因此,试验中确定的最佳浓度和使用时间同样可应用于实际生产。试验结果显示,200倍P.monteilii3A菌液对TMV钝化效果最好,与育苗棚、育苗盘的接触时间应不少于20 min,剪叶机械应浸泡1 min以上。与其他化学抗病毒制剂或消毒剂相比,P.monteilii3A菌液主要表现为具有活性的生防菌,安全、持续、无污染和低碳。这就为当前有机无公害生态农产品的生产提供了必要的条件,值得推广应用。

国内外已有很多有关假单胞菌作为生防菌的研究,结果表明,P.monteilii可以胞外分泌酯酶[17]。徐丽等的研究显示P.monteilii可作为五味子植株根内生菌抑制五味子茎基腐病菌、穿山龙黑斑病菌及人参锈腐病菌的活性[18]。翟熙伦的研究表明,蒙氏假单胞菌4A1菌株发酵液中的活性物质可破坏TMV粒体,对病毒产生钝化作用,破坏病毒蛋白亚基之间的作用力,使病毒粒体缺乏完整性,从而无法在寄主体内增殖,降低病毒的侵染能力[19]。本研究的3A菌株为蒙氏假单胞菌,对烟草漂浮育苗中TMV的钝化效果显著,对植物病毒病的防治有潜在的应用价值,但是其与TMV在烟草植株内的作用机制还有待进一步深入研究。

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(责任编辑：田喆)

Passivation effect ofPseudomonasmonteilii3A onTobaccomosaicvirusin tobacco float seedlings

Yuan Lianlian1, Wang Yaofeng2, Liu Xiangfu3, Jin Zhiwei4, Zhang Jing5, Li Wei5,Dong Shifei5, Zhao Cunxiao2, Huang Mingdi6, Wang Fenglong1, Yang Jinguang1

(1.TobaccoResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofTobaccoPestMonitoring,Controlling&IntegratedManagement,Qingdao266101,China; 2.QingyangTobaccoCompany,GansuTobaccoCooperation,Qingyang745000,China; 3.ChinaNationalLeafTobaccoCorporation,Beijing100055,China; 4.GansuTobaccoCooperation,Lanzhou741306,China; 5.HongyunandHongheTobacco(Group)Co.,Ltd.,Kunming650231,China;6.LongnanTobaccoCompany,GansuTobaccoCooperation,Longnan746000,China)

Pseudomonasmonteilii3A strain was selected to evaluate the passivation effect onTobaccomosaicvirus(TMV) in tobacco seedlings by real-time RT-PCR, combined with the incidence and disease index of the virus disease. The results showed thatP.monteilii3A bacterial liquid with different concentration gradients (200, 400 and 600×) had significant passivation effects on TMV in the residual dry roots and leaves of the old seedling sheds and trays. Meanwhile, using the clipping tool treated withP.monteilii3A bacterial liquid could reduce the incidence and disease index of the virus disease, and the relative control effect was 51.42%-100%.P.monteilii3A bacterial liquid could reduce the amount of TMV in the matrix polluted with TMV through bio-passivation by 72.73%-88.46%, and the relative control effect on the virus disease was 61.56%-87.46%. The best dilution ofP.monteilii3A bacterial liquid was 1∶200, and the optimum contact time on old seedling sheds and trays was no less than 20 min. Meanwhile, the clipping tools should be treated more than 1 min.

Tobaccomosaicvirus(TMV);Pseudomonasmonteilii3A; float seedling

2016-03-24

2016-06-07

甘肃省烟草公司科技项目(2015-08)

S 435.72

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.006

* 通信作者 E-mail:jinguangyang@126.com