白头翁汤正丁醇提取物对小鼠外阴阴道念珠菌病的治疗作用研究

段强军 云云 陈志珍 邵菁 汪天明 汪长中

(1.安徽中医药大学 中西医结合临床学院，合肥 230038；2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所,合肥 230038)

中药复方白头翁汤出自《伤寒论》，由白头翁、黄连、黄柏、秦皮4位中药组成，临床治疗外阴阴道念珠菌病 (vulvovaginal candidiasis,VVC)效果显著。本课题组[1-3]通过不同极性溶剂提取白头翁汤后证实，其正丁醇提取物 (Butyl alcohol extract of BaiTouWeng，BAEB)对体外白念珠菌具有明显抑制作用，对VVC模型小鼠也具有很好治疗作用。VVC的发病除了白念珠菌本身的毒力因子如黏附、酵母—菌丝相转化、生物被膜形成、外分泌水解酶产生等之外，机体能否积极调动免疫力来对真菌抗感染也至关重要。目前认为，固有免疫在阻止真菌病的发生上比适应性免疫更加重要，前者主要包括屏障作用、吞噬作用以及正常体液中的抗菌物质。近年来发现，作为固有免疫重要组成的炎症小体 (inflammsome )在真菌等病原体感染中发挥重要作用。本文拟研究BAEB如何从炎症小体角度发挥其抗VVC作用。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌SC5314由第二军医大学姜远英教授惠赠。

药物 白头翁汤 (白头翁15 g、黄柏12 g、黄连6 g、秦皮15 g)购买于安徽中医药大学第一附属医院并经鉴定，参照张梦翔等[3]方法制备白头翁汤正丁醇提取物。氟康唑胶囊购买于广东彼迪药业有限公司，批号：国药准字H20059399。

动物 清洁级雌性昆明种小鼠72只 (20±2.0) g，由安徽医科大学实验动物中心提供。

试剂 FastQuant RT Kit (with gDNase)试剂盒 (北京天根生物有限公司)，IL-1β、IL-18的ELSIA试剂盒 (南京森贝伽生物有限公司)；Trizol试剂盒 (invitrogen公司)；cDNA第一条链合成试剂盒 (北京天根生物有限公司)；SYBR○RGreen试剂盒 (QIAGEN公司)。

仪器 DPH-9162型电热恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)，BH2显微镜 (OLYMPUS)，TS-12A生物组织自动脱水机、HH-2数显恒温水浴锅 (江苏省金坛市友联仪器研究所)，HM325切片机 (Thermo)，BM-1X生物组织包埋机 (孝感市宏业医用仪器有限公司)，Spectra Max M2e多功能酶标仪 (美谷分子仪器有限公司)，Eppendorf 5417R高速冷冻离心机 (德国Eppendorf公司)；ABI普通PCR仪 (美国生物应用系统公司)ABI 7000荧光定量PCR仪 (美国生物应用系统公司)。

1.2 方法

菌液配制 在沙氏平板上无菌挑取白念珠菌菌落，接种至液体沙氏培养基中，37℃电热恒温培养箱中培养24 h后取出，离心，弃上清，将浓度调成3×106CFU/mL使用。

实验分组 将72只雌性昆明种小鼠随机分为6组，每组12只，分为正常组、VVC模型组、氟康唑治疗组、BAEB治疗组 (20 mg·kg-1,40 mg·kg-1,80 mg·kg-1)，除了正常组之外其他组都要先建立VVC模型。

VVC小鼠模型建立[4]首先将每只小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.1 mg，每隔1 d注射1次，一共注射3次。第6天后，用无菌蒸馏水对小鼠阴道进行灌洗，然后对灌洗液进行涂片，染色，观察是否有小鼠阴道上皮细胞，若有上皮脱落，将准备好的白念珠菌菌液 (3×106CFU/mL)，每只10 μL接种小鼠阴道内，接种后将小鼠倒立3 min以防止菌液流出，同样操作持续接种3 d。

药物治疗及效果观察 在VVC模型复制成功1 d后，对小鼠进行治疗。其中氟康唑组每日用20 mg·kg-1剂量的氟康唑进行灌胃，每天1次；BAEB治疗组分别用 (20,40,80) mg·kg-1BAEB进行灌胃，每天1次，连续治疗1周。采用30 μL的生理盐水对小鼠阴道进行灌洗，取20 μL灌洗液经稀释后涂布于平板上。37℃培养1天后观察并计数平板上白念珠菌菌落的数量，然后计算出阴道内白念珠菌载荷量。

HE染色观察组织小鼠阴道组织病理学 取小鼠阴道组织浸泡于10%甲醛溶液中1周，然后进行石蜡包埋、切片，切片厚度为4 μm，HE染色后，显微镜下观察形态学改变情况。

ELISA检测小鼠阴道IL-1β、IL-18含量 取组织于匀浆器中，加入1 mL无菌水匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液待测，按照ELISA试剂盒操作测定组织中IL-1β、IL-18的含量。

qRT-PCR检测组织TLR2、TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA相对变化 采用TRZOL按照说明书依次提取各组组织mRNA，取5 μL RNA按照逆转录试剂盒进行第一条链合成，采用SYBR荧光染料法，反应体系为25 μL：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR，PCR Primer各1 μL，模板0.5 μL，ddH2O 10 μL。在ABI7000荧光扩增，PCR体系为95℃预变性3 min，扩增定量程序为40个循环：变性95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 45 s；内参基因选用GAPDH，实验重复3次。所有引物委托上海生工合成引物，引物情况见表1。

表1 各引物序列表

1.3 统计学处理

计量资料以均数±标准差表示，各组均数的比较采用单因素方差分析，应用SPSS 17.0软件进行统计，P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 BAEB对各组小鼠阴道组织形态学改善

与正常组 (见图1A)相比，模型组小鼠阴道黏膜层完全破坏，大量炎症细胞浸润 (见图1B)。与模型组比较，BAEB组呈现出不同程度的改善，其中，BAEB高剂量组炎症浸润较少，中、低剂量组存在轻度炎症浸润 (见图1C、1D、1E)。氟康唑组小鼠阴道黏膜炎症浸润较少 (见图1F)。

2.2 BAEB对VVC小鼠阴道真菌载荷量的影响

与正常组小鼠比较，VVC模型组小鼠阴道灌洗液中白念珠菌载荷量 (CFU/mL)显著升高，差异具有统计学意义 (P<0.001)(见图2)。药物治疗后，与模型组比较，BAEB高剂量、中剂量、低剂量、氟康唑组小鼠真菌载荷量均有下降，差异具有统计学差异 (P<0.001)，其中BAEB高剂量组、氟康唑组下降较为显著 (见图2)。

2.3 BAEB对VVC小鼠阴道组织中IL-1β、IL-18的影响

与正常组相比较，模型组小鼠阴道组织中IL-1β、IL-18含量均显著上升，差异具有统计学意义 (P<0.001，见图3)。BAEB治疗后，高剂量组、中剂量组、低剂量组、氟康唑组的IL-1β、IL-18含量降低，差异具有统计学意义 (P<0.001，见图3)，其中高剂量组最明显。

2.4 BAEB对VVC小鼠阴道组织中TLR2、TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表达的影响

与正常组相比较，模型组小鼠TLR2、TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达分别上调了6.26、6.50、4.81、3.07、4.12倍，差异具有统计学意义 (P<0.001，见图4)。与模型组比较，BAEB高剂量组TLR2、TLR4、NLRP3、caspase-1的mRNA分别上调了3.56、3.47、2.53、3.02，中剂量对于上述基因上调倍数分别为4.13、5.12、2.99、3.47，差异均具有统计学意义 (P<0.001)。此外，高剂量组对于ASC基因上调2.57，其中BAEB低剂量对于NLRP3基因的表达相比于模型组，具有统计学差异 (P<0.001)。

3 讨 论

鉴于固有免疫在真菌感染中的重要作用，而炎症小体是近年来发现的固有免疫的一个重要组成，且在外阴阴道念珠菌病 (VVC)中发现存在过度激活现象，故本研究试图从炎症小体角度探讨白头翁汤正丁醇提取物 (BAEB)对VVC的治疗作用。

炎症小体 (inflammasome)是一类由胞浆内模式识别受体 (Pattern recognition receptors，PRRs)参与组装的多蛋白复合体，能够识别病原体病原体相关分子模式 (Pathogen associated mole-cular patter,PAMPs)或者宿主来源的危险信号分子 (Damage associated molecular patterns,DAMPs)。NLR蛋白如NLRP1、NLRP3、NLRC4以及非NLR家族成员如AIM2以及Pyrin均能形成炎症小体并具有较明确的生理功能。NLRP3是目前研究最多的一种炎症小体[5]。

图1各组小鼠阴道组织形态学改变 (HE，200×)：A.正常组,B.模型组,C.BAEB高剂量组,D.BAEB中剂量组,E.BAEB低剂量组,F.氟康唑组图2各组小鼠阴道灌洗液中白念珠菌载荷量 (与正常组相比较，###P<0.001，与模型组相比较，***P<0.001)图3各组小鼠阴道组织匀浆中IL-1β、IL-18的含量 (与正常组相比较，###P<0.001，与模型组相比较，**P<0.01,***P<0.001)图4各组小鼠TLR2、TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA变化倍数 (与正常组相比较，###P<0.001；与模型组相比，***P<0.05,**P<0.001)

Fig.1Morphological changes of vaginal tissue in each group (HE staining,200×)Fig.2The CFUs ofCandidaalbicansin vaginal lavage fluid of each groupFig.3The levels of IL-1β and IL-18 in the vaginal tissue homogenate of each groupFig.4The expressions of TLR2,TLR4,NLRP3,ASC and caspase-1 in each group

NLRP3炎症小体由识别分子NLRP3、接头分子ASC以及效应分子半胱天冬酶1 (capase-1)组成。NLRP3炎症小体具有多种激活剂，可以被真菌、细菌、病毒等病原体PAMP，以及ATP、尿酸晶体、β淀粉样纤维等DAMP所激活[6-7]。

真菌感染时，真菌表面的葡聚糖、甘露聚糖等PAMP识别免疫细胞TLRs并活化NF-κB，后者上调NLRP3、IL-1β和IL-18前体的表达。NLRP3再进一步进行自身寡聚化，并招募接头分子ASC，后者招募并使caspase-1前体自身剪切活化，活化的caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，产生相应的成熟细胞因子，引起宿主炎症反应[4-5]。

研究表明，VVC时由于NLRP3炎症小体过度激活会造成了IL-1β和IL-18大量产生以及阴道内中性粒细胞的大量招募，从而引起阴道黏膜的损伤[8-10]。因此，鉴于NLRP3炎症小体在VVC中过度活化所造成的致病性作用，NLRP3炎症小体被视作药物干预VVC的一个潜在的靶标。

本实验结果显示，VVC模型组小鼠阴道内真菌载荷量呈现出高水平，组织匀浆中IL-1β、IL-18呈现高表达，组织形态学显示出大量炎症细胞浸润，与黄月娜等[11]的研究结果基本一致。BAEB治疗7 d后，小鼠阴道真菌载荷量均有不同程度降低，阴道组织病理有不同程度的改善，IL-β、IL-18的含量也有显著降低。进一步的qRT-PCR结果显示，VVC模型组小鼠阴道组织的TLR2、TLR4的mRNA呈现出高表达水平，而BAEB治疗后TLR2、TLR4的转录水平有不同程度的降低，尤其以BAEB高剂量最为显著。另外，针对NLRP3炎症小体的组成成分，VVC模型组小鼠NLRP3、ASC及caspase-1的基因呈现高水平转录，BAEB高剂量干预后能够显著抑制NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA的表达。

本研究表明，BAEB对VVC具有显著疗效，同时发现对NLRP3炎症小体具有明显下调作用。但BAEB如何通过NLRP3炎症小体发挥抗VVC的详细机制还有待于进一步探讨。且由于中药复方多成分、多靶点的作用特点，BAEB中诸多的活性成分分别作用于炎症小体中的哪些具体组分尚有待于进一步揭示。

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[3] 张梦翔,夏丹,施高翔,等.白头翁汤正丁醇提取物对碱性pH条件下白念珠菌VVC临床株形态转化的影响[J].中国中药杂志,2015,40(4):710-715.

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