补中益气汤对A549/DDP移植瘤裸鼠中Bad，NF—κB，caspase—9，Survivin，mTOR表达的影响

2017-03-28刘亚莉易佳丽刘春英

中国中药杂志 2017年4期

刘亚莉+易佳丽+刘春英

[摘要] 探討补中益气汤对A549/DDP移植瘤裸鼠中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR表达的影响。BALB/C裸鼠60只随机分为空白对照组、荷瘤对照组、顺铂组和补中益气汤高剂量+顺铂组（高联组）、补中益气汤中剂量+顺铂组（中联组）、补中益气汤低剂量+顺铂组（低联组），培养A549/DDP细胞（浓度为5×106个/mL），接种于各组，观察各组成瘤情况。给予相应治疗，14 d后取瘤组织固定、切片，免疫组织化学方法、Real-time PCR方法检测各组裸鼠移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR 蛋白和mRNA的表达水平。结果显示补中益气汤联合顺铂可降低移植瘤体积，中联组和高联组的抑瘤率与顺铂组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；与荷瘤对照组比较，中联组和高联组Bad，NF-κB，Survivin，mTOR的蛋白和mRNA的表达明显减少（P<0.05），caspase-9的蛋白和mRNA在中联组和高联组的表达逐渐增多，与荷瘤对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；Bad，NF-κB，caspase-9的mRNA，中联组和高联组与顺铂组、低联组、荷瘤对照组比较有统计学意义（P<0.05），低联组、顺铂组、荷瘤对照组两两比较，无统计学差异，各因子蛋白和mRNA的表达中联组和高联组比较，无统计学意义。结果表明补中益气汤与顺铂联合作用可抑制A549/DDP移植瘤的生长，补中益气汤抑制A549/DDP移植瘤的作用可能是通过调节Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR，促进细胞凋亡实现的。

[关键词] 补中益气汤； A549/DDP；裸鼠； Bad； NF-κB； caspase-9； Survivin； mTOR

[Abstract] This study was aimed to explore the effects of Buzhong Yiqi decoction on the expression levels of Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， and mTOR in nude mice with A549/DDP transplantation tumors.Sixty BALB/C mice were randomly divided into blank control group， tumor-bearing control group， cisplatin group and Buzhong Yiqi decoction of high， medium and low doses+cisplatin groups （hereinafter referred to as the high，medium and low combined groups）. A549/DDP cells （concentration of 5×106 cells/mL）were cultured and inoculated in various groups， then the tumor-forming situations were observed. Corresponding treatment was given in all groups. Fourteen days later， immunohistochemistry and Real-time PCR methods were used to detect the expression levels of Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， mTOR protein and mRNA in tumors.Results showed that Buzhong Yiqi decoction combined with cisplatin could reduce the volume of transplanted tumors， and there was significant difference between medium combined group and high combined group（P<0.05）. As compared with the tumor-bearing control group， the expression levels of Bad， NF-κB， Survivin and mTOR were significantly reduced in medium and high combined groups（P<0.05）； the protein and mRNA expression levels of caspase-9 were gradually increased in medium combined and high combined groups（P<0.05）， with statistical difference with tumor-bearing control group（P<0.05）. There were statistical difference in mRNA expression of Bad， NF-κB and caspase-9 between medium combined group， high combined group and cisplatin group， low-combined group， tumor-bearing control group（P<0.05）， but there was no statistical difference between cisplatin group， low-combined group， and tumor-bearing control group. In addition， there was no statistical difference between medium combined group and high combined group in protein and mRNA expression levels of various factors. Experimental results showed that Buzhong Yiqi decoction combined with cisplatin can inhibit the growth of A549/DDP transplanted tumors， and the mechanism may be associated with regulating Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， and mTOR levels as well as promoting apoptosis.

[Key words] Buzhong Yiqi decoction； A549/DDP； nude mice； Bad； NF-κB； caspase-9； Survivin； mTOR

肺癌已成为威胁居民健康的主要疾病之一，其发病率的上升趋势与吸烟等不良生活方式的增多、空气质量下降等因素有关[1]。肺癌作为肿瘤死亡的首要原因，受到全世界的广泛研究。肺癌由于不易及早发现，在失去手术治疗机会时就只能以放、化疗为主。化疗的客观有效率约30%，中位生存期8～10个月，1年生存率30%～40%，且不良反应较严重，多数患者难以完成有效的治疗周期[2]。袁惠芳等[3]发现采用培美曲塞联合铂类方案治疗晚期肺癌时加以补中益气汤辅助，可在一定程度上提高联合用药疗效，并明显减轻化疗所致胃肠反应，降低不良反应发生风险，提高患者治疗期间生活质量。刘明等[4]研究发现化疗联合补中益气汤加减在治疗中晚期非小细胞肺癌时临床疗效有所提高，而且在明显改善患者生活质量的基础上有效降低骨髓抑制的发生率。

本研究将人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP细胞接种裸鼠，制备成荷瘤模型，用不同浓度的补中益气汤和顺铂进行干预，将顺铂作为阳性对照，采用一般性观察、免疫组织化学、Real-time PCR等方法，评价补中益气汤对移植瘤生长的影响，并探讨其作用机制，为应用补中益气汤干预肺癌顺铂耐药提供实验依据。

1 材料

1.1 动物及细胞 BALB/C裸鼠，SPF级，5周龄，雌雄各半，体重（20±2） g，购自北京维通利华动物实验技术中心，动物许可证号SCXK（京）2012-0001，A549和A549/DDP细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究中心细胞库。

1.2 药物制备补中益气汤生药购于辽宁中医药大学附属医院药房，组成参照《方剂学》新世纪版规定，按“动物与人体的每千克体重剂量折算系数表”[5]，计算裸鼠的等效剂量，按成人日推荐量的2，1，1/2倍设置高、中、低剂量组。常规煎制成每毫升含生药3.939，1.970，0.985 g。

1.3 仪器及试剂 formaUL-1168751H CO2孵育箱（Thermo Fisher Scientific美国）；PE 9700PCR扩增仪（美国）；KOHTRON高速低温离心机（瑞典）；BT-31恒温水浴振荡仪（日本，KAMAMOTO）；紫外分光光度计（英国UV-visible Spectrometer，UV300）。Survivin抗体、mTOR抗体（南京凯基生物技术有限公司），鼠抗人Bad，NF-κB，caspase-9单克隆抗体（PTGLAB公司），Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]，引物合成由北京华大基因公司提供。注射用顺铂（齐鲁制药厂生产，生产批号2030132DB）。

2 方法

2.1 细胞悬液配制人肺腺癌耐药细胞株 A549/DDP按常规5%CO2，37 ℃孵育箱中培养，每2 d换液1次，0.25%胰蛋白酶消化，3～4 d传代1次。传代扩增细胞数量至足够时，收集对数生长期A549/DDP细胞，0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，1 000 r·min-1离心5 min，去上清液，以PBS洗涤，调整细胞浓度为5×106个/mL，制备成A549/DDP细胞悬液。

2.2 移植瘤制备及標本收集 60只裸鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为6组：①空白对照组，②荷瘤对照组，③顺铂组，④补中益气汤高剂量+顺铂组（高联组），⑤补中益气汤中剂量+顺铂组（中联组），⑥补中益气汤低剂量+顺铂组（低联组），每组10只。①组裸鼠给予腹股沟皮下接种0.2 mL/只生理盐水；②～⑥组裸鼠给予腹股沟皮下接种A549/DDP细胞悬液0.2 mL/只。观察各组成瘤情况，待肉眼观察到移植瘤出现时，空白对照组、荷瘤对照组给予生理盐水0.5 mL灌胃；顺铂组给予等量生理盐水灌胃的同时，腹腔注射顺铂2 mg·kg-1；高联组、中联组、低联组分别给予高、中、低浓度的补中益气汤0.5 mL灌胃，同时腹腔注射顺铂2 mg·kg-1，每日1次，14 d后，无菌剥离瘤体，称瘤重，游标卡尺测量肿瘤最大长径（a）和横径（b），瘤体标本部分用10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，免疫组化检测；部分迅速置于-80 ℃冰箱保存，做Real-time PCR。

2.3 免疫组化方法检测移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR的表达取出固定样本，经常规脱水，透明、浸蜡，包埋后，将每个样本蜡块连续切片3张，每张厚约4～5 μm。切片常规脱蜡至水，PBS清洗5 min，2次，高压热修复，内源性过氧化物酶阻断，PBS清洗5 min，2次，加一抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗5 min，2次，加二抗37 ℃孵育45 min，PBS清洗5 min，2次，DAB显色，透明后封片。以PBS代替一抗作为阴性对照组。免疫组化结果采用Image Pro Plus医学图像分析系统进行图像分析，在400倍高倍镜下，分别测出阳性反应细胞的总面积（Area）和积分光密度（IOD），求出平均光密度（AOD）。

2.4 Real-time PCR技术检测各组移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR mRNA的表达利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，PCR 引物见表1。取各组样品，分别进行总RNA的提取，待样本纯度检测计算合格后，按逆转录试剂盒说明进行逆转录合成cDNA，反应条件37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s，1个循环。进行PCR扩增，反应条件为95 ℃ 0.5 min，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，1个循环；PCR扩增的反应体系为20 μL。各基因完成PCR扩增循环后，进行产品熔解曲线分析，以确定产品纯度。根据PCR产物熔解曲线的平均熔解温度确定产物的纯度。根据系统给出数值，计算各组mRNA的表达比率，进行分析。

2.5 统计学分析运用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析。计量资料采用±s表示。各组数据符合正态分布，方差齐时，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法；不符合参数检验者，采用多组计量资料秩和检验。P<0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 补中益气汤对荷瘤裸鼠一般状况的影响各组实验动物活动良好，未见明显的拒食、不安、便溏现象。高联组裸鼠体重与空白对照组比较，无明显变化，各组间无统计学差异。致瘤率以实验结束时，解剖出瘤组织并经HE染色证明为标准，高联组有2只，中联组有1只，未出现瘤组织，从样本含量上给予剔除。随着补中益气汤剂量的增加，移植瘤体积减小，高联组、中联组抑瘤率与顺铂组比较差异有统计学意义（P<0.05），低联组与顺铂组比较则无显著差异，见表2。

3.2 免疫组织化学方法检测各组移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR蛋白表达各组Bad，NF-κB，Survivin，mTOR的表达显示，各组中均有棕黄色颗粒表达，荷瘤对照组最多，顺铂组和低联组表达量有所减少，而中联组和高联组表达最少。统计学分析显示，中联组和高联组与荷瘤对照组、顺铂组、低联组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；低联组、荷瘤对照组、顺铂组两两比较无统计学差异；中联组和高联组比较则无统计学意义，见图1～5。

caspase-9蛋白在各组中的表达情况为：荷瘤对照组中棕黄色颗粒最少，中联组和高联组棕黄色颗粒最多，顺铂组和低联组居中。经统计学分析：中联组和高联组与荷瘤对照组、低联组和顺铂组比较有统计学差异（P<0.05），低联组、顺铂组和荷瘤对照组两两比较则无统计学意义。见图3，6。

4 讨论

在肺癌的化疗过程中，耐药和毒副反应是多种多样的。如食欲减退、呕吐、骨髓抑制等。对补中益气汤的研究很多，沈富林等[7]研究证明，在多种肿瘤的联合化疗方案中采用补中益气方，均可有效减轻化疗的毒副反应。除此之外，将单纯化疗法和化疗联合补中益气汤法进行对比研究，可以发现，与单纯化疗组相比，联合组患者毒副反应的发生率显著降低，李雁等[8]进行的相关研究证实了此结果。同时，还有大量的研究表明，在肿瘤尤其是肺癌的化疗方案中，应用补中益气汤药不但缓解患者在化疗期间的不适反应，还可提高放疗耐受性，特别是能够减少放射治疗所致炎症反应[9]。本研究以先天性缺乏胸腺的裸鼠为研究对象，采用典型的肺腺癌细胞系A549/DDP细胞，以皮下移植的方式造模，呈瘤率都在90%以上。在增加了补中益气汤的干预后，与顺铂组比较，抑瘤率明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），提示补中益气汤与顺铂的抑瘤作用有协同效应。免疫组化的结果表明，顺铂联合补中益气汤干预后Bad，NF-κB，Survivin，mTOR蛋白的表达明显减少，caspase-9蛋白的表达增多，与顺铂组比较有统计学差异（P<0.05），提示联合应用顺铂和中、高剂量的补中益气汤后，下调了肿瘤组织中抗凋亡因子Bad，NF-κB，Survivin，mTOR等因子的表达，并且上调促凋亡因子caspase-9的表达，而在基因检测方面，Real-time PCR的结果显示以上各因子mRNA的表达与蛋白表达的变化是一致的，提示补中益气汤对肺癌顺铂耐药相关因子的干预是在基因水平上发生的，增加肿瘤细胞的凋亡，从而使瘤组织体积缩小。

顺铂在进入肿瘤细胞之后，与细胞的DNA形成加合物并激发细胞周期的停止和凋亡过程的启动，所以在此过程中，阻碍顺铂与DNA的加合物形成，或其调节肿瘤细胞周期引发肿瘤细胞凋亡的因素都有可能引起顺铂耐药[10]。核因子-κB（NF-κB）是广泛存在于真核生物中的一种多功能的核转录因子，在恶性肿瘤的发生、发展和转移中有重要的促进作用，这是因为NF-κB能够控制多种细胞因子和生存基因表达[11]。Survivin是一种在肿瘤内皮细胞中持续表达的特异性凋亡抑制因子，抑制Survivin的表达可有效减少肿瘤血管的生成，有研究证明，肿瘤细胞中大多数血管生成或抑制因子都是通过调节Survivin的表达来发挥作用的[12]。王淳等[13]研究发现补中益气汤含药血清可激活A549 细胞内caspase-3依赖的细胞凋亡发生，其作用是通过提高A549细胞ROS水平，并激活其下游各级激酶产生的。王雨等[14-15]研究发现补中益气汤不但可上调caspase-9 mRNA和蛋白表达水平，也可增加caspase-3 蛋白的表达，从而使二者共同作用，增强诱导肿瘤细胞凋亡的作用。促凋亡蛋白Bad通过结合并灭活抗凋亡的Bcl-2家族蛋白发挥促进凋亡的作用。在之前的研究中，本课题组已经阐述补中益气汤可能通过调控PI3K，AKT基因和蛋白的表达而干预顺铂的耐药机制，并且这种干预作用具有一定的量效关系[16]。PI3K/AKT通路可导致细胞凋亡的抑制，顺铂与肿瘤细胞的DNA结合后，即DNA收到了损伤，这种损伤信息可激活PI3K/AKT通路，从而引起细胞凋亡阈值增高，产生了对顺铂的耐受。本研究为了解补中益气汤在PI3K/AKT信号转导通路中的作用，检测了此通路下游促凋亡蛋白Bad，NF-κB，caspase-9以及Survivin和mTOR在补中益气汤干预时表达的变化，为解释临床应用补中益气汤改善肺癌顺铂耐药提供实验依据。

综上，补中益气汤抑制肺癌肿瘤生长的作用，可能是通过调节A549/DDP细胞中的促凋亡蛋白Bad，NF-κB，caspase-9以及Survivin和mTOR，促進肿瘤细胞凋亡而实现的，补中益气汤是培土生金法的代表方药，对肺癌患者补虚扶正、培本固元、改善患者生活质量、逆转肺癌顺铂耐药的作用，值得进一步研究。

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