山楂叶黄酮类成分的测定方法研究进展*

王领弟，臧亚茹，邢 婧，刘振华，徐宝欣，潘海峰△

（1.承德医学院附属医院药剂科，河北承德 067000；2.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室)

山楂叶黄酮类成分的测定方法研究进展*

王领弟1，臧亚茹1，邢 婧1，刘振华1，徐宝欣2，潘海峰2△

（1.承德医学院附属医院药剂科，河北承德 067000；2.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室)

山楂叶；黄酮类成分；测定方法；质量控制

山楂叶作为常用中药材被收载于《中国药典》2010版一部，具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂的作用，用于气滞血瘀、胸痹心痛、胸闷憋气、心悸健忘、眩晕耳鸣和高脂血症[1]。研究表明，山楂叶生理活性的主要成分为黄酮类成分，包括牡荆素、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、芦丁、槲皮素等[2-6]。本文就近年来对山楂叶黄酮类成分的测定方法研究进展进行综述，为其质量控制提供依据。

1 黄酮类成分的定性检测

1.1 显色反应

1.1.1 紫外光下呈色反应：取山楂叶样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈棕色并有荧光斑点。

1.1.2 三氯化铝反应：取山楂叶样品溶液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液，吹干呈灰黄色，在紫外光下呈黄绿色荧光斑点。

1.1.3 氨水反应：取山楂叶样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏半分钟，立即在紫外光下观察，呈黄绿色荧光斑点。

1.1.4 盐酸-镁粉反应：取山楂叶样品溶液1ml于试管中，加适量镁粉，滴加浓盐酸数滴，呈桃红色泡沫反应。

1.1.5 锆-枸橼酸反应：取山楂叶样品溶液1ml于试管中，滴加2%氢氧化锆，此时溶液呈黄色；再滴加2%枸橼酸甲醇溶液，并加水稀释，此时黄色减退，再加水则为无色。

1.1.6 乙酸镁反应：取山楂叶样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。

1.2 纸层析 取山楂叶样品溶液点在滤纸上，用正丁醇-醋酸-水=4：1：5为展开剂，上行展开4小时，取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液，吹干后于紫外灯下检视，可见相应荧光斑点。

1.3 聚酰胺薄膜色谱法 取山楂叶样品溶液点在聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开后晾干。喷1%三氯化铝醇溶液，吹干后于紫外灯下检视，可见相应荧光斑点[7]。

1.4 液质联用法 液质联用（HPLC-MS）是以液相色谱作为分离系统、质谱为检测系统，样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。乔晓莉等[8]以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相，采用UPLC/ESI-TOF/MS获得山楂化学成分的二级质谱数据，高效、准确地鉴别了牡荆素葡萄糖苷、金丝桃苷、槲皮素等黄酮类成分。许红蕾等[9]以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，通过液相色谱-二极管阵列光谱检测-电喷雾离子化质谱（HPLC-DAD/ESI-MS）联用技术，定性分析出山楂叶中牡荆素、牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮素-3-鼠李糖-半乳糖苷、牡荆素-4"-O-乙酰-2"-O-鼠李糖苷等黄酮类成分， 该方法灵敏度高、专属性强。

2 黄酮类成分的定量测定

2.1 分光光度法 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。张文莉等[10]采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和AlCl3两种显色系统，以芦丁为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定山楂叶提取物中总黄酮的含量。结果：NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法（510nm）测定含量为86.15%，AlCl3显色法（272nm）测定含量为35.19%，两种方法所得测定结果相差较大，但对于何种方法更适合用于山楂叶提取物中总黄酮的测定还有待进一步研究。杨少冉等[11]用紫外-可见分光光度法测定了不同采收期承德产山楂叶中总黄酮的含量，进行动态分析，结果以6月份所含总黄酮含量最高。

2.2 三波长分光光度法 在双波长测定方式中，一般是寻找干扰成分的等吸光点，从而使整个吸收光谱上下平移来消除干扰成分的影响，但往往会碰到干扰成分的吸收光谱没有吸收峰，因而找不到合适的等吸光点的情况，此时用双波长法必然会影响测定的准确度。三波长分光光度法除了能将吸收光谱上下平移，也能校正它的倾斜度，因而当在干扰成分的吸收光谱上找不到等吸光点时，应用三波长测定法更加准确[12-13]。张兰杰等[14]以λ1=463nm、λ2=417nm、λ3=382nm的三波长分光光度法测定山楂叶、果总黄酮的含量，有效地消除了吸收峰不对称给黄酮定量分析造成的影响，并校正了干扰组分的吸收光谱产生的基线倾斜，提高了定量分析的准确度。

2.3 高效液相色谱法 高效液相色谱（HPLC）是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。因具有操作简便、快速、准确可靠、重现性好和专属性强等特点，HPLC法已广泛应用于山楂叶黄酮类成分的含量测定。王肖等[15]以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）-四氢呋喃（C）为流动相，用HPLC法对山楂叶样品溶液进行梯度洗脱，对不同月份的承德产山楂叶中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷进行了含量测定，结果：牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷和金丝桃苷的含量均以6月份最高，牡荆素和芦丁的含量均以7月份最高。张文洁等[16]以甲醇-乙腈-四氢呋喃-0.4%醋酸水（6：：1.5：18.5：74）为流动相，首次采用HPLC法梯度洗脱对山楂叶总黄酮中多酚类成分的药代动力学进行研究，确定了牡荆素-4"-O-葡萄糖苷（VG）、牡荆素-2"-O-鼠李糖苷(VR)和牡荆素(VIT)在血浆样品中含量的测定方法，该方法专属性强，分离度较好。张雪莹等[17]采用多波长RP-HPLC法，以乙腈（A）-0.025mol/ml磷酸水（B）为流动相进行梯度洗脱，结果：在检测波长为363nm（0-18min）和371nm（18-30min）的条件下，同时测定出了山楂叶中芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量，该方法快速、准确、重现性好。

2.4 微乳液相色谱法 微乳液相色谱（MEIC）应用较多的是水包油型反相MEIC，其分离机制是溶质在固定相、伪固定相（表面活性剂在固定相的吸附层）、多相分散相（微乳液滴）、水相进行的动态吸附解析过程。由于分离过程的复杂性，可控参数较多，使得具有不同极性的组分在等度洗脱下，在短时间内达到有效分离。李宁等[18]以SDS-正辛醇-正丁醇和Brij35-正辛醇-正丁醇微乳体系为流动相，选择Venusil ASB C18色谱柱对山楂叶提取物进行分离，稳定、快速地测定出了山楂叶提取物中牡荆素鼠李糖苷、芦丁、牡荆素、金丝桃苷4种黄酮类成分的含量。

2.5 超高效液相色谱法 超高效液相色谱（UPLC）借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。刘亭亭等[19]以乙腈（A）-0.3%甲酸水（B）为流动相，梯度洗脱方式，用UPLC法对含山楂叶成分的三叶片中芦丁和金丝桃苷的溶出度进行了测定，结果准确，可重复性好。

2.6 一测多评法 一测多评是指利用中药有效成分内在的函数关系和比例关系，只测定一个成分（对照品可得到者）实现多个成分（对照品难以得到或难供应）的同步测定。一测多评法经济、方便、高效，既能解决中药对照品匮乏的问题，又能实现中药及其制剂的多组分定量。杨明宇等[20]以流动相0.1%甲酸（A）-乙腈（B）-四氢呋喃（C） 进行梯度洗脱，以牡荆素葡萄糖苷为内参物，计算山楂叶中牡荆素葡萄糖苷对牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷的RCF值，进而进行含量测定，相对误差均小于5%，符合考量尺度。

3 小结

山楂叶含有的黄酮类成分在心脑血管系统[21-22]和抗肿瘤方面[23-24]的临床应用具有广阔的发展前景。目前，对黄酮类成分的研究越来越深入，对其结构分析要求也越来越高。通过对山楂叶黄酮类成分的测定方法研究进展进行总结，以期为研究人员提供更全面的参考依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社,2010.30.

[2]高东雁,刘健,李卫平,等.山楂叶总黄酮对大鼠心肌缺血性损伤的保护作用及机制研究[J].中药药理与临床,2012,28（5）：64-66.

[3]李红,张爽,纪影实,等.山楂叶总黄酮不同给药途径对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国老年学杂志,2012,32（5），995-997.

[4]闵清,白有庭,余薇,等.山楂叶总黄酮对缺氧再给氧心肌细胞的保护作用及机制研究[J].中药药理与临床,2011,27（1）：30-33.

[5]杨华,张知贵,李小慧.山楂叶总黄酮对高脂血症大鼠血脂和血液流变性的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,1（812）：257-259.

[6]齐淑芳,赵晓莲，王跃新，等.山楂叶总黄酮对糖尿病大鼠肾脏TGF-β-1/Smad4信号转导通路的影响[J].中成药,2012, 34（9）：1795-1797.

[7]李文莉.聚酰胺薄膜色谱法鉴别心安胶囊中的牡荆素鼠李糖苷[J].江苏药学与临床研究，2003，11（6）：65.

[8]乔晓莉,吴士杰,祁向争,等.山楂中化学成分的UPLC/ESI -TOF/MS分析[J].现代药物与临床,2014,29（2）：120-124.

[9]许红蕾,周婷婷,范国荣,等.山楂叶化学成分的HPLC-DAD /ESI-MS分析[J].药学实践杂志，2009，27（1）：40-42.

[10]张文莉,高敏,石森林.分光光度法测定山楂叶提取物中总黄酮的含量[J].中华中医药学刊,2011,29（5）：1148-1151.

[11]杨少冉,高菁,陈艳昆,等.紫外-可见分光光度法动态分析承德地区山楂叶总黄酮的含量[J].承德医学院学报,2014, 31（1）：78-79.

[12]周菊峰，彭爱娇.三波长分光光度法测定药用百合中总黄酮[J].西北药学杂志，2011，26（3）：165-166.

[13]尚永辉,孙家娟,刘彬,等.三波长分光光度法测定葡萄籽中总黄酮含量[J].分析科学学报,2013,29（5）：706-708.

[14]张兰杰,辛广,陈华，等.三波长-分光光度法测定山楂叶、果总黄酮的含量[J].食品与生物技术学报，2009,2（84）：483-486.

[15]王肖,杜义龙,赵胜男,等.承德产山楂叶中总黄酮和5种黄酮类成分含量的动态分析[J].中国实验方剂学杂志,2013, 19（17）：171-175.

[16]张文洁,吴学军,冷爱晶.HPLC测定静脉给药山楂叶提取物大鼠血浆中三种黄酮含量[J].辽宁中医杂志,2015,4（23）：638 -640.

[17]张雪莹，张杨，张建逵，等.多波长RP-HPLC测定山楂叶中芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量[J].中华中医药学刊，2011，29（9）：1987-1989.

[18]李宁,黄光亮,李玉兰,等.微乳液相色谱法同时测定山楂叶提取物中4种黄酮成分[J].分析化学,2009,3（712）：1791-1794.

[19]刘亭亭，张德芹，王萌，等.UPLC法同时测定三叶片中4种成分的溶出度[J].中成药，2014，36（11）：2294-2297.

[20]杨明宇，高婧，杜义龙，等.一测多评法同时测定山楂叶中6种有效成分的含量[J].中国药房，2016，27（24）：3404-3407.

[21]袁芳.山楂叶总黄酮对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡的影响[J].现代中西医结合杂志，2016,25（4）：368 -371.

[22]吴晓光,李玲,苗光新,等.山楂叶总黄酮对血管性痴呆大鼠学习记忆的干预作用及机制[J].中国老年学杂志,2015,35（14）：3819-3822.

[23]Choi J,Kim T,Lee S. Pro-apoptotic effect and cytotoxicity of genistein and genistin in human ovarian cancer SK-OV-3 cells [J].Life Sci，2007,8（015）:1403-1408.

[24]唐世英,胡桂才,杨凤国,等.山楂叶总黄酮对人类单核肿瘤细胞增殖的影响[J].中药新药与临床药理,2010,21（3）：269 -270.

R284

A

1004-6879（2017）05-0424-04

2016-12-15）

* 河北省中医药管理局项目（2016190），承德市科学技术研究与发展计划项目（201601A043），河北省高等学校科学技术研究重点项目（ZD2015097）

△ 通讯作者