糙米酵素混菌发酵工艺优化

张旭普 - 白俊岩 - 刘腾云 - 吴荣荣 - 程书梅 -

(1. 河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2. 衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000)

糙米(Brownrice)是指除了外壳之外都保留的全谷粒，其营养及保健价值均大于精白米[1]，但由于口感较粗，蒸煮耗时，不符合现代人饮食习惯，而加工成精白米造成食物资源浪费达10%～20%[2]。糙米酵素是在糙米中加入蜂蜜、麦芽等，采用酵母等发酵而成的功能性食品基料。微生物通过本身的中间代谢，使底物产生一系列的生物化学变化，不仅改善了口感[3]，而且在保留原有营养的基础上又通过微生物代谢产生了很多诸如γ-谷维醇[4-6]、GABA和GSH等[7-8]生理活性物质。关于糙米酵素的研究国外起步较早，日本和美国已有众多相关发酵文献，部分酵素产品如米乳米露等已经面世并广泛销往港澳台等地[2]。中国近年已有糙米酵素的研究报道，较多学者集中探讨了糙米酵素合适的发酵工艺条件，如陈庶来等[1]以还原糖消耗量为指标优化了发酵时间，酵母活化时间及添加量；张丽萍等[2]以酸度及感官评定为指标分别对配方及发酵工艺作了改进；吕美等[3]以GSH为指标确定了糙米米糠的配比、加水量、蜂蜜添加量及玉米胚油的添加量。

但传统的糙米酵素发酵工艺存在几点缺憾：① 原料未进行灭菌，只靠优势菌种发酵，发酵不易控制且易染菌[9]2-3；② 处理工艺未经过糖化，很多不具有产淀粉酶的菌株不能有效利用糙米中的碳源，使得发酵不完全，发酵剂开发受限[9]3-5；③ 大部分糙米酵素的发酵采用固态或半固态发酵，相关参数不易控制[2]。本实验室改进了以上部分工艺，利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)与本实验室保藏的植物乳杆菌L42(Lactobacillusplantarum)混合发酵[10]，在预试验的基础上[11]，利用PB试验(Plackett-Burman)[12]、最陡爬坡试验[13-14]和响应面BB试验(Box-Behnken)[15]对混合发酵培养基进行优化，旨在较短的发酵时间内获得理论最大活菌数,以确保GABA与GSH等代谢产物的积累[16-17]。通过改进糖化工艺使多菌种发酵成为可能，添加灭菌工艺使纯种发酵不易受影响,同时便于活菌计数排除杂菌干扰，并以活菌量作为发酵指标进行配方优化，旨在为后续的酵素生产工艺及产物测定研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；

植物乳杆菌L42：由本实验室筛选及保藏。

1.2 材料与试剂

MRS肉汤：北京奥博星生物技术有限公司；

蛋白胨：北京双旋微生物培养基制品厂；

酵母浸粉：英国Oxoid公司；

蜂蜜：桂林周氏顺发食品有限公司；

糙米：黑龙江鹤岗市五谷农家养生坊；

大麦芽、小麦芽：烟台市帝伯仕啤酒技术有限公司；

云南大叶种晒青毛茶叶：云南品润有限公司；

NaCl、(NH4)2SO4：分析纯，天津市福晨化学试剂厂。

1.3 培养基

YPD培养基(供酿酒酵母种子活化使用)：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；

MRS培养基(供植物乳杆菌种子活化使用)：根据瓶装说明称取48 g/L，加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15 min后冷却备用；

基础发酵培养基：洋槐蜂蜜8 g，发芽糙米粉9 g，小麦芽粉1 g，NaCl为1 g，晒青毛茶粉0.1 g，加水至100 mL，糖化液化后经巴氏灭菌冷藏，6 h内接种。发酵液初始pH为5.8，可溶性固形物含量为11.0 °Brix。

1.4 仪器与设备

水浴恒温振荡器：LY20-A型，上海龙跃仪器设备有限公司；

离心机：LD5-2A型，北京京立离心机有限公司；

洁净工作台：SW-CJ-1FD型，苏州安泰空气技术有限公司；

生化培养箱：SPX-250B-Z型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

酸度计：PHS-25型，上海仪电科学仪器有限公司。

1.5 工艺流程及操作要点

糙米发芽处理[18-19]→干燥→粉碎(过80目筛)→培养基调配→糖化液化(升温程序：37 ℃保温10 min；52 ℃保温40 min；65 ℃保温1 h；78 ℃保温10 min)[20-22]→冷却→200目滤布过滤→离心取上清液(4 360×g，时间15 min)→调配→巴氏杀菌(62 ℃保温35 min，杀菌强度约62.09 PU)[23]→冷却→接种→发酵(12 h)→糙米酵素

1.6 可溶性固形物含量的测定

采用手持阿贝折光仪测定。

1.7 培养方法

用接种环分别挑取酿酒酵母和植物乳杆菌L42一环菌种于YPD种子培养基与MRS种子培养基的试管中，充分震荡，在34 ℃培养箱中分别静置培养。根据已测定的生长曲线，在10 h和15 h时分别达到对数生长期末期取出，以3 mL/100 mL(酵母约1.71×107CFU/mL，乳酸约2.15×108CFU/mL)接种量转接到含有糙米基础发酵培养基的三角瓶中，34 ℃恒温振荡培养12 h后取出，梯度稀释涂布于MRS平板计算活菌数[24]。

1.8 试验设计

1.8.1 PB试验设计 在预试验的基础上，以7种组分即蜂蜜、糙米、小麦芽、大麦芽、NaCl、(NH4)2SO4和茶作为因素，选用试验次数N=9的试验方法进行PB试验设计，2个虚拟变量用于误差估计，每个因子选取高低两个水平，高水平是低水平的2倍。根据结果分析，选取3个主要影响因素[25]。

1.8.2 最陡爬坡试验 根据PB试验得到的最优一阶方程，以及实际试验情况确定3个重要影响因素的爬坡方向和步长，从而得到3个因子的最佳组合浓度范围以逼近最大响应区域[26]。

1.8.3 响应面试验设计(RSM) PB试验确定了3个主要影响因素，最陡爬坡试验确定了最大响应区域以及响应区域的中心点，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，取3个主要影响因素的3个水平，设计3因素3水平的Box-Behnken试验[27-29]。

1.8.4 数据分析 试验处理均包含3个平行试验，取值为3个试验的平均值。Plackett-Burman试验设计和Box-Behnken试验设计采用Design Expert.V8.0.6软件完成。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验筛选重要影响因素

Plackett-Burman试验因素和水平见表1。以活菌数(Y1)为响应值，试验设计及响应值见表2。各因素的影响效果见表3。

表1 Plackett-Burman试验因素和水平

表2 Plackett-Burman试验设计及响应值

表3 Plackett-Burman试验各因素对活菌数的影响效果

由表3可知，该模型高度显著(0.01蜂蜜>NaCl>大麦芽>小麦芽>茶叶>(NH4)2SO4，糙米具有极显著影响(P<0.01)，蜂蜜和NaCl具有高度显著效应(0.01

Y1=+3.91-0.46F1+0.59F2-0.15F3+0.29F4-0.43F5-0.023F6-0.042F7。

(1)

该方程拟合R2=0.939 1，能较好地模拟和解释PB试验的结果。本模型的精密度(Adeq Precision)为9.965>4，从而进一步说明该模型较为可靠。

2.2 最陡爬坡试验逼近最大响应区域

根据PB试验得到的最优一阶方程可知，对活菌数有正效应的因素为糙米和大麦芽，说明这2个因素在高水平时混菌增殖更为有利。对活菌数有负效应的因素为蜂蜜、小麦芽、NaCl、(NH4)2SO4和茶叶，说明这5个因素在低水平时对混菌增殖更为有利。各试验因素对响应值Y1影响的显著性顺序为糙米>蜂蜜>NaCl>大麦芽>小麦芽>茶叶>(NH4)2SO4，其中糙米、蜂蜜和NaCl为显著影响因素，糙米应在现有质量浓度上继续增大，蜂蜜和NaCl应在现有质量浓度上继续减少，其余因素按照其正负效应选取适当浓度，即大麦芽、小麦芽、茶叶和(NH4)2SO4质量浓度分别为0.25，0.50，0.025，0.50 g/100 mL设计最陡爬坡试验，水平和结果见表4。

表4 最陡爬坡试验路径设计及结果

在第5组试验即蜂蜜、糙米、NaCl添加量分别为3.00，10.50，0.25 g/100 mL时，活菌数最大，因此选取第5组试验中各显著影响因子浓度作为响应面试验的中心点。

2.3 Box-Behnken试验设计

根据Plackett-Burman试验获得的3个重要影响因素以及最陡爬坡试验得到的最佳质量浓度，分别选取3个水平，以活菌数作为响应值(Y2)设计3因素3水平的Box-Behnken试验。各因素及水平见表5，试验设计及结果见表6。

表5 Box-Behnken试验因素及水平

表6 Box-Behnken试验设计及响应值

2.3.1 二次回归模型与方差分析 通过软件Design Expert.V8.0.6对BB试验17组数据进行回归分析，并经过回归方程拟合，得到各试验因子对响应值影响的函数表达式为：

Y2=+5.35+0.10A+0.13B-0.030C+0.11AB-0.17AC+0.22BC-0.43A2-0.37B2-0.22C2。

(2)

利用方差分析对回归方程进行F检验，F值为16.52，且大于F的概率低于0.000 6，说明该方程是显著的，模型可信度高。其中A、B、AC、BC、A2、B2、C2对响应值影响显著，表明三因素对试验结果的影响不是简单的线性关系，模型的R2=0.955 0，调整后为0.897 2，说明该模型能较好地模拟和验证试验结果，预测拟合度Pred-R2为0.814 2，说明它与校正决定系数保持一致，能够解释试验结果；变异系数C.V.%=2.56，置信度比较高；本模型精密度(Adeq Precision)=10.199>4，说明模型可以反映真实的试验值。Box-behnken试验方差分析见表7。

为直观说明蜂蜜、糙米和NaCl对于混菌发酵活菌数的影响，运用软件Design Expert.V8.0.6做出3个重要影响因子之间交互作用的响应曲面图和等高线图，见图1～3。

表7 Box-Behnken试验方差分析†

†R2为0.955 0；Adj-R2为0.897 2；Pred-R2为0.814 2。

图1 糙米与蜂蜜对活菌数交互影响的曲面图和等高线图Figure 1 The surface and contour maps of the interaction effects of brown rice and honey on Y2

图2 蜂蜜和NaCl对活菌数交互影响的曲面图和等高线图Figure 2 The surface and contour maps of the interaction effects of honey and NaCl on Y2

图3 糙米和NaCl对活菌数交互影响的曲面图和等高线图Figure 3 The surface and contour maps of the interaction effects of brown rice and NaCl on Y2

2.3.2 重要影响因素最终质量浓度的确定及结果验证 通过Design Expert.V8.0.6分析可知蜂蜜、糙米和NaCl最佳编码值分别为0.756，0.198，-0.260，分别对应实际值为3.38，10.71，0.24 g/100 mL，为了验证模型准确性，采取优化后的增殖培养基即蜂蜜3.38 g/100 mL、糙米10.70 g/100 mL、NaCl 0.24 g/100 mL、小麦芽0.25 g/100 mL、大麦芽0.50 g/100 mL、(NH4)2SO40.50 g/100 mL、茶叶粉0.025 g/100 mL 进行混菌发酵12 h，含有活菌数为5.35×107CFU/mL，基本与响应面预测的活菌数(5.21×107CFU/mL)接近，是基础糙米酵素培养基活菌数(5.71×106CFU/mL)的9.37倍。

3 结论

目前糙米酵素大多只采用酵母单菌发酵且工艺流程相对简单，难以进行科学量化评价。本试验在前人探究的基础上增加了糖化和巴氏灭菌工艺，并对酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵作了相关研究，确定蜂蜜、糙米、NaCl、小麦芽、大麦芽、(NH4)2SO4、茶叶粉添加量分别为3.38，10.71，0.24，0.25，0.50，0.50，0.025 g/100 mL。由试验结果可知蜂蜜、糙米和NaCl的比例和交互作用对混菌活菌数影响较大，说明合适的碳氮比，渗透压以及生长因子的作用是酵母和植物乳杆菌发酵良好的关键。本研究可为混菌发酵糙米酵素提供参考，同时为发酵生产相关产品提供试验基础与理论依据。

但由于本试验采用涂布平板进行菌落计数，操作繁琐且容错率低，后续试验可考虑采用活菌染色后显微镜计数以加强试验模型精确度；同时本试验仅以活菌数为指标来评价酵素产品发酵工艺，对得出的产品中生理活性物质未进行研究，后续可对此进行更深入的研究，从而优化得到功能性与口感风味兼顾的平衡功能性饮料。

[1] 陈庶来, 杨小明, 刘伟民, 等. 糙米酵素发酵工艺的研究[J]. 食品科学, 2005, 26(7): 275-277.

[2] 牛广财, 朱丹, 李志江, 等. 我国糙米酵素的研究进展[J]. 中国酿造, 2010(1): 12-14.

[3] 吕美, 齐森, 贾磊, 等. 糙米酵素的发酵工艺[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(10): 111-113.

[4] NEWMAN R K, BETSCHART A A, NEWMAN C W, et al. Effect of full-fat or defatted rice bran onserum cholesterol[J]. Plant Foods Hum Nutr, 1992, 42: 37-43.

[5] HEE S, PARK B S, LEE H G. Hypocholesterolemic action of fermented brown rice supplement in Cholesterol-fed rat Cholesterol-lowering action of fermented brown rice[J]. J Food Sci, 2005, 70(8): 527-531．

[6] HEGSTED M, WINDHAUSER S . Stabilized rice bran and oat bran lower cholesterol in human[J]. Nutrition Research, 1993, 13: 387-389.

[7] 李飞, 隋新, 苏红, 等. 不同发酵条件对糙米酵素中活性成分的影响[J]. 中国酿造, 2016, 35(11): 162-165.

[8] 李志江, 牛广财, 鹿保鑫, 等. 糙米酵素发酵工艺条件的研究[J]. 中国酿造, 2008(22): 65-67.

[9] 袁周率. 糙米酵素的研发及其抗细胞凋亡作用的研究[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2015.

[10] 傅亮, 王丽丽, 田利春. 发酵型营养米乳的研制[J]. 食品与机械, 2006, 22(5): 103-105.

[11] 胡渊, 刘成国, 黄茜, 等. 干酪乳杆菌增殖培养基的优化研究[J]. 食品与机械, 2014, 30(2): 21-22.

[12] MILLE A, SITTER R. Using the folded-over 12-run plachett-burman design to consider interactions[J]. Technometrics, 2001, 43: 44-54.

[13] 韩玉洁, 谢应根, 王永华, 等. 响应面分析法优化L-乳酸发酵培养基的研究[J]. 食品与机械, 2006, 22(4): 54-56.

[14] 宋一恒, 谢定, 钟海雁. 响应面法优化酵母富硒发酵条件[J]. 食品与机械, 2009, 25(6): 125-129.

[15] 刘丽莎, 陶国琴, 郭宏, 等. 响应面法优化豆乳链球菌增殖培养基[J]. 食品科学, 2014, 35(11): 124-128.

[16] 梁宝东, 魏海香, 江均平.L-乳酸细菌发酵培养基的优化[J]. 食品与机械, 2008, 24(1): 41-45.

[17] 魏敏, 张斌, 王宁宁, 等. 副干酪乳杆菌耐乳酸的驯化及增殖培养基的优化[J]. 食品与机械, 2014, 30(2): 25-30.

[18] 杨椰. 发芽糙米研发进展[J]. 粮油食品科技, 2011(3): 19-23.

[19] 金增辉. 糙米酵素及其产品开发[J]. 粮食与油脂, 2002(4): 14-16.

[20] 王志坚. 糖化工艺主要技术参数的确定[J]. 山东食品发酵, 2002(2): 41-44.

[21] 朱凤娇, 陈叶福, 王希彬, 等. 上面发酵高粱啤酒的工艺研究[J]. 现代食品科技, 2017, 33(9): 1-6.

[22] 管敦仪, 唐是雯. 《啤酒工业手册(修订版)(精)》新版发行[J]. 食品与发酵工业, 2008(8): 17.

[23] 唐建民, 王福泉, 陆培基, 等. 格瓦斯饮料的巴氏消毒效果的初步观察[J]. 食品科学, 1983(9): 38-39.

[24] 周德庆. 微生物学教程[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 2008: 151-152.

[25] 滕国生, 刘勇, 武丽达, 等. 响应面优化L-赖氨酸培养基[J]. 食品与机械, 2015, 31(5): 256-260.

[26] TRUPKIN S, LEVIN L, FORCHIASSIN F. Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and syn-thetic dye decolorization using response surface methodology[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2003, 30: 682-690.

[27] AMBAT P, AYYANNA C. Optimizing medium constituents and fermentation conditionsfor citric acid production from palmyrajaggery using response surface method[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2001, 17: 331-335.

[28] 鲁晶晶, 王远亮, 谢梦琴. 植物乳杆菌LJ-3产细菌素的响应面优化[J]. 食品与机械, 2014, 30(5): 242-246.

[29] PURI S. Optimization of alkaline protease production from Bacillus sp.by Response Surface Methodology[J]. Current Microbiology, 2009, 4: 286-290.