microRNA-183通过下调Bcl-2诱导人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡的研究

马国祥 丁茜萍 邓海华 杨振汉

广东深圳市宝安区福永人民医院内科 深圳 518103

microRNA-183通过下调Bcl-2诱导人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡的研究

马国祥 丁茜萍 邓海华 杨振汉

广东深圳市宝安区福永人民医院内科 深圳 518103

目的 研究microRNA-183对神经母细胞瘤细胞的调控作用，为神经母细胞瘤的治疗提供新策略。方法 购买microRNA-183和对照 microRNA，转染至人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞，再使用MTT实验，Caspase-3活性测定试剂盒和流式检测细胞生长和凋亡的影响。合成Bcl-2 siRNA，检测Bcl-2对人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡的影响。转染Bcl-2质粒后，再转染microRNA-183至人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞，分析Bcl-2的表达水平和人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的凋亡。结果 转染microRNA-183降低SK-N-SH细胞的生长(P=0.005 9)，发生磷脂酰丝氨酸膜表面表达(P=0.008)和Caspase-3的激活(P=0.014)，Bcl-2的表达降低(P=0.015)。干扰SK-N-SH细胞中Bcl-2增强了microRNA-183诱导的细胞凋亡(P=0.005 8)，而过表达Bcl-2抑制了microRNA-183诱导的细胞凋亡(P=0.007 3)。结论 转染microRNA-183抑制SK-N-SH细胞的生长和增殖。microRNA-183通过下调Bcl-2而诱导SK-N-SH细胞的凋亡，提示Bcl-2可能是神经母细胞瘤潜在的候选治疗靶点。

细胞凋亡；microRNA-183；Bcl-2；SK-N-SH细胞

神经母细胞瘤严重威胁着患者的生活和健康[1]。神经母细胞瘤的治疗主要包括放化疗、手术治疗、分子靶向治疗等[2]，针对不同的患者，上述治疗方法疗效均显著，然而，也存在毒副作用强、适用人群少、分子靶点的选择难等缺点[3-4]。microRNA调控细胞生长、凋亡和增殖作用[5]。在动物实验中，microRNA常被作为癌症治疗的分子靶点[6]。然而，microRNA-183对神经母细胞瘤细胞生长和凋亡的调控作用尚不清楚。因此，本研究以人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞为细胞模型，探讨microRNA-183对人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞可能的调控机制，以期为神经母细胞瘤分子靶点的治疗提供理论依据。

1 实验试剂和方法

1．1 实验试剂和实验细胞 小鼠源抗人Bcl-2的多克隆抗体，HRP标记的羊源抗小鼠的IgG单克隆抗体，内参抗actin内参的多克隆抗体来源于美国Santa Cruz生物技术有限公司。细胞培养用血清和培养基来源于华兰生物用品公司。MTT试剂盒来源于碧云天生物技术研究所。细胞凋亡试剂来源于北京鼎国科技有限责任公司公司。

microRNA如microRNA-83(5′-ACATCACA-TCGGTAGTTGCCAT-3′和5′- AAACAAAGAGGTAAAGGTGCA-3′)，对照microRNA(5′-CCAACGAGTGTCTTTCGAGC-3′和5′-TTGACGTTT-CACGATACAT-3′)和siRNA Bcl-2(5′-CTACGTGCTACCATGGATGC-3′和5′-TTCTAGAACTACGCTATGT-3′)，Bcl-2的质粒来源于上海生物工程有限公司。Lipo2000转染试剂来源于美国Invitrogen。

1．2 细胞培养的方法 复苏人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞，将人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞重悬于DMEM培养基中，37 ℃，5% CO2[7]。

1．3 转染方法 将microRNA-183和对照micro-RNA转染至人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞。将人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞铺板于24孔板，密度30%左右，将microRNA-183和对照microRNA加入lipo2000中，混匀，室温放置7 min，将混合液加入细胞中，37 ℃，5% CO2[8-9]。

1．4 MTT试剂盒检测细胞活性 按照MTT试剂盒的说明检测人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的活性[10]。首先，接种人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞。按1.3的描述向人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞转染microRNA-183或对照miRNA后，再加入1 mg/mL MTT反应液，培养人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞24 h。最后在细胞里加入终止反应液DMSO，终止反应。

将6孔板人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞放入酶标仪中，测试人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞在560 nm处的吸收值，绘制人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞生长曲线[11]。

1．5 流式细胞术检测细胞凋亡 人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的凋亡情况使用流式检测。首先，接种人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞。按1.3的描述向人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞转染microRNA-183或对照miRNA后，向200 μL体积的细胞中加入16 μL的反应液和2 μL的染料Annexin-V-FITC，避光反应14 min。最后上流式检测[12]。1．6 聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot免疫印迹 首先，接种人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞。按1.3的描述向人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞转染microRNA-183或对照miRNA后，收集细胞，向细胞中加入细胞裂解液裂解，制备聚丙烯酰胺凝胶电泳样品，进行电泳，电泳结束转膜、封闭，孵育一抗、二抗，最后进行显影、定影[13]。

1．7 Caspase-3活性测试 按照试剂盒的说明检测人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的凋亡情况。首先，接种人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞。按1.3的描述向人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞转染microRNA-183或对照miRNA后，裂解细胞，向细胞样品中加入生色底物反应。最后在酶标仪上测试各组样品的光吸收值[14]，作为细胞Caspase-3活性的相对值。

2 结果

2．1 转染microRNA-183降低了人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的活性 各实验组的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞活性通过MTT测试，与转染对照miRNA的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞相比，转染microRNA-183后，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的生长被显著抑制(P=0.005 9)。见图1。

由于转染对照miRNA的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞和未转染组人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的活性差异无统计学意义(P>0.05)，所以，以转染miRNA细胞组作为对照。

图1 转染microRNA-183降低了人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的活性，抑制其生长 与miRNA组相比，**P<0.01 图2 转染microRNA-183引起人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的凋亡与miRNA组相比，**P<0.01

2．2 转染microRNA-183引起人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的凋亡 如图2所示，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞磷脂酰丝氨酸的外翻，与转染对照miRNA的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞相比，转染microRNA-183后，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻的量显著增加(P=0.008)。

2．3 转染microRNA-183引起人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中Caspase-3的活化 图3中人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中细胞凋亡的检测数据提示，与转染miRNA的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞相比，转染microRNA-183后，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡增加(P=0.014)。

图3 转染microRNA-183引起人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的Caspase-3的活化 与miRNA组相比，*P<0.05 图4 转染microRNA-183引起人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中Bcl-2蛋白表达的下降

2．4 转染microRNA-183引起人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中Bcl-2蛋白表达的下降 如图4所示，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中细胞凋亡的检测数据提示，与转染对照miRNA的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞相比，转染microRNA-183后，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞细胞凋亡增强(P=0.015)。

2．5 敲低Bcl-2增强microRNA-183引起的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡 如图5所示，降低Bcl-2的表达后，再转染microRNA-183后，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡增加(P=0.007 6)。microRNA-183组和siBcl-2+microRNA-183细胞凋亡差异有统计学意义(P=0.005 8)。

图5 敲低Bcl-2增强microRNA-183引起的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡 与miRNA组相比，*P<0.05；microRNA-183组和siBcl-2+microRNA-183细胞凋亡比较，#P<0.05

2．6 转染Bcl-2抑制了microRNA-183诱导的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡 图6中Western blot结果表明，Bcl-2的质粒转染增加了其水平。microRNA-183组和Bcl-2+microRNA-183组间Bcl-2比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图6示，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中细胞凋亡的检测结果表明，转染Bcl-2增强Bcl-2水平后，再转染microRNA-183后，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡被明显抑制(P=0.006)。microRNA-183组和Bcl-2+microRNA-183细胞凋亡差异有统计学意义(P=0.007 3)。

图6 转染Bcl-2抑制了microRNA-183诱导的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡与miRNA组相比，*P<0.05；microRNA-183组和Bcl-2+microRNA-183比较，#P<0.05

3 讨论

本研究以人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞为细胞模型，从蛋白水平上研究了microRNA-183对人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的调节机制，结果显示，转染microRNA-183降低了人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的生长，引起人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡。这与前人研究结果高度一致，即microRNA调控细胞生长和细胞凋亡[15]。

Bcl-2蛋白是Bcl-2蛋白家族中重要的细胞凋亡抑制蛋白之一[7-8]。据研究报道，Bcl-2可能受microRNA-183的调节，进而调节人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞[9-10]。本研究结果证明，转染microRNA-183降低了Bcl-2的蛋白水平。转染microRNA-183和降低Bcl-2的表达后，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的凋亡增加，而转染Bcl-2则抑制了microRNA-183诱导的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡。

本文采用不同的方法证明了Bcl-2蛋白在microRNA-183诱导的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡中的作用：(1)Western blot结果显示，microRNA-183高表达时，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中的Bcl-2蛋白显著降低；(2)转染Bcl-2 siRNA后，再转染microRNA-183至人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞后，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡增强；(3)转染Bcl-2质粒后，再转染microRNA-183至人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞，人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡被显著抑制。结果表明，Bcl-2蛋白在microRNA-183诱导的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡中发挥关键作用，Bcl-2蛋白是潜在的神经母细胞瘤的分子靶点[11-12]。Bcl-2可抑制癌细胞的细胞凋亡[13-14]，这是一致性的结论。

本文的不足和缺点如下：(1)缺少临床神经母细胞瘤的样本和对照组织中Bcl-2蛋白水平的结果；(2)缺少预后临床神经母细胞瘤的样本和对照组织中Bcl-2蛋白水平的结果；(3)缺少神经母细胞瘤的小鼠模型和以microRNA-183为靶点治疗的神经母细胞瘤小鼠的疗效结果。

转染microRNA-183抑制人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的生长和增殖，microRNA-183通过下调Bcl-2而诱导人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的凋亡，提示Bcl-2可能是神经母细胞瘤潜在的候选治疗靶点。

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(收稿2016-10-20)

microRNA-183 induces apoptosis of human neuroblastoma cell line SK-N-SH by down regulating Bcl-2 disease rats

MaGuoxiang，DingQianping，DengHaihua，YangZhenhan

FuyongPeople'sHospitalofShenzhenBaoanDistrict，Shenzhen518103，China

Objective To study the regulation of microRNA-183 on neuroblastoma cells and to provide a new strategy for the treatment of neuroblastoma．Methods microRNA and microRNA-183 were transfected into SK-N-SH cells，and then MTT experiment and Caspase-3 activity assay and flow cytometry were employed to investigate the role of microRNA-183 in growth and apoptosis of human neuroblastoma cell line SK-N-SH．Bcl-2 siRNA was transfected into SK-N-SH cells，and effects of Bcl-2 on human neuroblastoma cell line SK-N-SH cells apoptosis was tested．After transfection of Bcl-2 plasmid，microRNA-183 was transfected into human neuroblastoma cell line SK-N-SH cells，and the expression level of Bcl-2 and apoptosis of human neuroblastoma cell line SK-N-SH were analyzed．Results The transfection of microRNA-183 reduced cell growth of the SK-N-SH cells (P=0.005 9)，and the expression of phosphatidylserine on the membrane (P=0.008) and activation of Caspase-3 were observed (P=0.014)，and the expression of Bcl-2 was decreased (P=0.015)．Bcl-2 interference of human neuroblastoma cell lines enhances apoptosis of the human neuroblastoma cell line SK-N-SH induced by microRNA-183 (P=0.005 8)，and overexpression of Bcl-2 inhibits apoptosis induced by microRNA-183 (P=0.007 3)．Conclusion The transfection of microRNA-183 inhibits the growth and proliferation of human neuroblastoma cell line SK-N-SH．MicroRNA-183 induces apoptosis of SK-N-SH by down regulating Bcl-2，which suggests that Bcl-2 may be a potential candidate therapeutic target for neuroblastoma．

Apoptosis；microRNA-183；Bcl-2；SK-N-SH cell

R730.264

A

1673-5110(2017)07-0003-04