小儿颠茄合剂微生物限度方法学验证

倪兆武，戴宇婷，陈睿彦

（昭通市食品药品检验所，云南 昭通 657000）

小儿颠茄合剂属于解痉止痛医院制剂，用于缓解胃肠痉挛引起的疼痛、恶心、呕吐等，为各医院常规制剂。微生物限度检查作为控制药品质量的一项重要指标，为了保证方法的适、，可靠，按照《中国药典》2015年版的规定，对小儿颠茄合剂的微生物限度检查方法适用性进行验证。

1 仪器与试药

1.1 样品、培养基及试药

小儿颠茄合剂（批号：160301、160314、160329），由某医院提供。胰酪大豆胨琼脂培养基TSA（批号：1 5 1 2 2 3）、沙氏葡萄糖琼脂培养基S D A（批号：1512292）、麦康凯液体培养基（批号：160111）、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：1512292）等培养基，以上均为北京三药科技开发公司产品，并进行过培养基适用性检查。其他试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 仪器与设备

LRH-250F生化培养箱（上海一恒科技有限公司生产），EZ-StreamTMPump六联过滤系统（密理博公司生产），BHC-1300ⅡA2生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司生产），YXQ-LS-75G压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司生产），Vitek2 Compact全自动微生物鉴定系统（法国梅里埃公司生产）。

1.3 试验菌株

大肠埃希菌[CCMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]，以上均由中国食品药品检定研究院提供，且菌株传代次数均为2代。

2 实验方法及结果

2.1 菌液的制备

分别将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、和黑曲霉培养物，用无菌0.9%氯化钠溶液制成每1 mL含菌或孢子数小于1000CFU的菌或孢子悬液，备用。

2.2 供试品的制备

取每个批号样品两份，将其混合均匀并作为供试液，取供试液作为原液，取原液，再用胰酪大豆胨液体培养基将供试液进一步稀释成1：10、1：100的供试液。

2.3 微生物计数法

2.3.1 倾注法回收率测定

2.3.1.1 试验组

取各稀释级供试液各9.9 mL，每个稀释级5份，每份中加入0.1 mL的试验菌悬液后摇匀，吸取1mL注入无菌平皿中。加金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的平皿倾注15～20 mL温度不超过45℃TSA，35℃培养3天，计数；加白色念珠菌、黑曲霉的平皿分别倾注15～20 mL温度不超过45℃TSA和SDA，倾注TSA的平皿于35℃培养5天，倾注SDA的平皿于25℃培养5天，逐日观察，计数。每种试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算数平均值作为计数结果。

2.3.1.2 供试品对照组

取制备好的供试液1mL至平皿中，每个稀释级平行4皿，其中2个倾注TSA，另2个倾注SDA，同法培养，计数。

2.3.1.3 菌液对照组

取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液（胰酪大豆胨液体培养基）替代供试液，按试验组操作加入试验菌液，同法培养，计数。

2.3.1.4 空白实验

以稀释液检查，同法培养，计数。

2.3.2 实验结果

采用常规法检查，在TSA中：原液供试品对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌人工染菌回收率均小于 50%，其余3种菌回收率在 0.5～2 范围内；1：10稀释级对5种菌的人工染菌回收率均在 0.5～2 范围内。在沙氏 葡萄糖琼脂培养基中：原液供试品对2种菌的人工染菌回收率均在0.5～2范围内。因此，本品原液需氧菌总数和霉菌及酵母菌总数的计数未达到要求，需要消除其抑菌活性或重新选择适当的方法再进行验证。但1：10稀释级的需氧菌总数和霉菌及酵母菌总数的计数结果符合要求。见表1。

表1 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数验证结果（CFU/mL）

2.3.3 薄膜过滤法

2.3.3.1 加入30 mL无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤润湿滤膜，取2.3.1.1、2.3.1.2、2.3.1.3的供试液及缓冲液1 mL过滤，用100 mL缓冲液冲洗，反复冲洗3次，并按2.3.1.1要求进行培养；逐天观察结果并记录。

2.3.4 实验结果

按倾注法回收率测定所述的计算公式，代入实验结果计算。本品采用薄膜过滤法进行测定，5种菌原液时的回收率均在0.5～2范围内。见表2。

2.4 大肠埃希菌检查方法

2.4.1 试验组

取原液及不大于100CFU的大肠埃希菌菌悬液各1 mL接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，35℃培养18～24 h。取上述培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，42℃培养24～48 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上35℃培养18～72 h。

2.4.2 阳性对照试验

接种不大于100CFU的大肠埃希菌至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，照试验组培养操作。

2.4.3 阴性对照试验

以稀释液代替供试液照试验组培养操作，见表3。

表2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数验证结果（CFU/mL）

表3 大肠埃希菌结果

3 讨 论

根据《中国药典》2015版的相关规定，为了确认所采用的方法适合用于某制剂的微生物限度检查，必须对相应检验方法进行方法学验证。因无法判定小儿颠茄合剂的成分，工艺对需氧菌、霉菌和酵母菌以及控制菌大肠埃希菌的抑菌程度，因此对不同稀释级的常规法进行考察。通过实验表明，原液时对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌抑菌明显，回收率达不到要求，以1：10的稀释级为最低稀释级可以开展检验，其次薄膜过滤法能很好消除抑菌影响，可以以原液为最低稀释级。

[1] 中国药典:四部[S].2015年:附录136-151。

[2] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].中国医药科技出版社.2010:351-382

[3] 严晓明,刘 萌,等.四种医院制剂微生物限度检查方法学验证[J].中国药事2015,29(5):485-491

[4] 曹 云,郭晓娟.药品微生物限度检查方法学验证及其相关的技术问题[J].天津药学,2006,18(06):259-260.