一株产香兰素的海洋放线菌的筛选及发酵条件的研究

赵希景

摘 要：本文以漳州古雷半岛潮间带沉积物作为研究对象，筛选出能够发酵代谢产香兰素的高产菌株。为海洋放线菌发酵代谢进入工业化生产做出理论依据。

关键词：古雷半岛潮间带；香兰素；阿魏酸

中图分类号：TQ920 文献标识码：A

0.引言

香兰又名香草醛，香草素等，其化学名称为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，分子量为152.16，熔点81℃～83℃。具有香荚兰的香气以及浓郁的奶香，是人们所喜爱的奶油香草精的主要成分，为香料工业中最大的品种。因此其用途十分广泛具有较高的工业应用价值。本文研究从古雷半岛潮间带中分离得到了45株海洋放线菌，其中可以利用阿魏酸转化生成香兰素的菌株有8株；对该8株海洋放线菌进行阿魏酸耐受性的筛选获得了一株可以高产香兰素的优秀菌株；对其发酵条件的初步研究表明在温度为35℃，pH为8.5，装液量为100mL/500mL时发酵单位最高可达到11.2g/L，摩尔转化率达到75%以上。这对于海洋资源的开发，以及微生物转化法生成香兰素提供了重要的理论依据。

1.材料和方法

1.1 样品采集

样品采集自漳州古雷半岛潮间带沉积物，去掉表层约10cm，使用预先备好的无菌样品勺采集10cm～20cm深处的沉积物样品1份，放入无菌三角瓶中，封口后放于冰盒中封存并带回实验室进行研究。

1.2 培养基

高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，Nacl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15g～25g，水1000mL，pH7.4～7.6。

放线菌发酵培养基：蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，葡萄糖20g，阿魏酸1.0g，海水100mL，定容至1000mL，初始pH为7.0～7.5，发酵pH为8.0～8.5。

菌种保藏培养基：酵母浸粉3.0g，蛋白胨3.0g，琼脂粉15g～25g，海水100mL，定容至1000L，pH7.0～7.5。

1.3 样品预处理

将1g样品在55℃水浴中加热5min；处理好后将沉积物样品使用式溶液使用1/4林格式溶液进行稀释。将稀释后的沉积物采用含有10%浓度海水的无菌水进行梯度稀释；采用平板涂布法将其涂布在含有10%海水的高氏一号培养基中，其中在培养基中添加千分之五的氨苄青霉素来抑制细菌的生长，同时还需添加浓度为0.1g/mL的制霉菌素溶液用来抑制霉菌等真菌的生长。28℃培养48h。

1.4 放线菌菌株分离与纯化

将在高氏一號培养基中长出的菌体，按照菌落大小，菌体形态，颜色等的不同挑选单菌落，采用点植法再次接种在含有10%海水的高氏一号培养基中。倒置培养与28℃培养箱中，培养48h。继续挑选单菌落采用点植法进行接种，重复划线；重复上述步骤2～3次。将纯化后的菌株使用保藏培养基进行保藏待用。

1.5 目标菌株的筛选

将分离得到的纯菌株培养至250mL茄子瓶中，培养28h后使用无菌水将菌体洗下，摇匀待用；取1mL菌悬液接种于装有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中于28℃180rpm摇床中培养28h。28h后将摇瓶取出12000rpm离心3min，取上清液过0.22μm水膜成为待测样品。

1.6 香兰素含量的测定

采用液相检测方法进行检测；检测条件为——柱子型号）色谱柱，流动相为A，B为0.1%磷酸缓冲液：甲醇（Av/Bv）=55∶45，流速为0.8mL/min，柱温30℃，检测波长为280nm紫外检测，进样量为0.5μL。

2.结果与分析

2.1 海洋放线菌的分离纯化

采用不同方式处理沉积物样品对样品分离放线菌的效果具有较大的影响，同时，取样的时间、地点以及海水的深度等外界条件对放线菌获得种类，数量均有较大的影响。据报道，采用通过55℃水浴6min处理样品可以获得最大数量的放线菌。本研究采用该种方法供分离得到了放线菌菌株45株。

2.2 产香兰素菌株的筛选

2.2.1 液相检测标准曲线的制作

使用香兰素，阿魏酸的标准品配置一定梯度浓度的标准溶液，使用香兰素液相的检测方法进样，检测出不同梯度浓度的香兰素和阿魏酸的标准曲线；香兰素的线性回归方程为Y=15479x-2.915，相关系数R2=0.999，阿魏酸的线性回归方程为Y=19393x-25.65，相关系数R2=0.999；均具有较好的线性关系。

2.2.2 目标菌株的筛选

将分离得到的45株放线菌进行摇瓶发酵，48h检测发酵液中香兰素的含量，其结果见表1。

从表1所示，我们可以看出初筛所得到的45株菌株中仅有8株菌株在发酵培养过程中产出香兰素；其中，菌株B-32产量最高，在含有阿魏酸1g/L的发酵液中可转化生成香兰素0.71g/L。其菌体浓度可达到OD620为0.21。菌株B-7，B-16，B-22，B-25，B-28，B-38，B-44在该发酵培养中也可以转化阿魏酸生成香兰素，其香兰素的摩尔转化率均在70%以上。从表中我们可以看出菌株B-4，B-13，B-34，B-41该4株菌株在发酵液中均可以生长，通过液相检测其中阿魏酸的含量明显减少，但是未发现有香兰素的生成。可能是由于在发酵过程中这4种菌可以利用阿魏酸产生其他类的代谢产物，值得我们拿出进行系统的研究。

结论

本研究从漳州古雷半岛潮间带沉积物中筛选出45株海洋放线菌，通过对45株放线菌进行筛选获得一株香兰素的高产菌株B-32；并对发酵条件进行初步的研究：在温度为35℃，pH为8.5，装液量为100mL/500mL条件下，可转化生成11.6g/L香兰素，转化率达到75%以上；这对于通过微生物转化方式生产天然香兰素提供了重要的理论依据。目前，对于菌株B-32发酵产香兰素的发酵条件的进一步优化，诸如碳源，氮源等正在进行中。

参考文献

[1]陈晓菲，高向东，顾觉奋.海洋放线菌及其产物的多样性[J].国外医药（抗生素分册），2013（1）：1-5.