高效液相色谱法同时测定邻位香兰素、香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素

贾 璇，王国胜

(沈阳化工大学 化学工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

香兰素，学名3-甲氧基,4-羟基苯甲醛，白色至淡黄色结晶粉末或针状结晶，熔点81～82 ℃，沸点285 ℃，是合成香料中全球生产量较大的，也作为中间体来合成药物和其他香料.在乙醛酸法合成香兰素过程中，由于反应物与反应条件的细小差异，会产生邻位香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素等副产物[1].邻位香兰素作为香兰素的同分异构体，学名2-羟基,3-甲氧基苯甲醛，黄绿色针状晶体或结晶状粉末，熔点40～42 ℃，沸点265.5 ℃，是重要医药中间体，也是合成盐酸黄连素的化工原料.邻位香兰素的合成主要来自于香兰素的二次精馏，由于熔沸点等物化性质接近，使其分离不彻底，因此其工业原料中还含有香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素等杂质.这印证了作为副产品的邻位香兰素，即使是市面上出售的所谓分析纯药品，其纯度也仅有98 %(质量分数).

目前，尚无对邻位香兰素工业原料中邻位香兰素，以及所含杂质甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素的官方检测方法.文献报道的测定方法主要有高效液相色谱法[2-6]、毛细管电泳法[7-9]、紫外分光光度法[10-11]以及气相色谱-质谱法、液相色谱法-质谱法[12-15].本文采用高效液相色谱法同时测定了邻位香兰素工业原料中邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素含量，方法简便快捷，灵敏度高，重现性好，以期为保证药品质量和人体健康提供技术支持.邻位香兰素、香兰素、甲基香兰素与乙基香兰素的分子结构如下：

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LCQ Deca XP Plus液相色谱质谱仪，美国Thermo Finnigan公司；邻位香兰素工业原料，东北制药集团有限公司；邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素对照品(质量分数≥99.0 %)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；醋酸铵(分析纯)，天津市永大化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯)，天津市大茂化学试剂厂；有机系微孔滤膜(孔径0.45 μm)，天津市津腾实验设备有限公司.

1.2 样品前处理

精密称取20 g邻位香兰素工业原料置于100 mL烧杯中，加入20 mL分析纯甲醇，搅拌至样品全部溶解.于-4 ℃冰箱冷凝结晶，结晶完全后抽滤，滤渣干燥至质量不再变化，室温密封保存待用.

1.3 对照品与样品溶液的配制

1.3.1 标准储备液的配制

精密称取邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素对照品各25 mg，分别放于25 mL容量瓶内，用色谱专用乙腈溶解、稀释至刻度，摇晃至均匀，得到相应标准储备液，质量浓度为0.99 g/L，于4 ℃冰箱保存.

1.3.2 混合标准工作溶液的配制

① 精密量取甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素标准储备液适量，置于容量瓶中，用乙腈-醋酸铵水溶液[V(乙腈)∶V(醋酸铵水溶液)=3∶7，c(醋酸铵水溶液)=0.02 mol/L]溶解、稀释至刻度，摇晃至均匀，得到混合标准工作溶液，质量浓度分别为99、9.9、0.99、0.099 mg/L，于4 ℃冰箱保存，供高效液相色谱仪测定.

② 精密量取邻位香兰素标准储备液适量，置于容量瓶中，用乙腈-醋酸铵水溶液[V(乙腈)∶V(醋酸铵水溶液)=3∶7，c(醋酸铵水溶液)=0.02 mol/L]溶解、稀释至刻度，摇晃至均匀，得到混合标准中间溶液，质量浓度分别为495、99、49.5、9.9 mg/L，于4 ℃冰箱保存，供高效液相色谱仪测定.

1.3.3 样品溶液的配制

称取前处理过的4批次邻位香兰素工业原料各25 mg，分别置于25 mL容量瓶中，用色谱专用乙腈溶解、稀释至刻度，摇晃至均匀，得到相应样品溶液，质量浓度为1 g/L，于4 ℃冰箱保存.之后精密量取样品溶液适量，置于10 mL容量瓶中，用乙腈-醋酸铵水溶液[V(乙腈)∶V(醋酸铵水溶液)=3∶7，c(醋酸铵水溶液)=0.02 mol/L]稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度为0.1 g/L的样品溶液，于4 ℃冰箱保存.

1.4 色谱条件

色谱柱：Spherigel C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-醋酸铵水溶液[V(乙腈)∶V(醋酸铵水溶液)=3∶7，c(醋酸铵水溶液)=0.02 mol/L]；流速：0.6 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；检测器：紫外检测器(UVD).

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素的特征吸收峰主要为229、278、308、279和309 nm.选择280 nm作为检测波长，在此波长条件下，各物质的出峰检测灵敏度均较高，并且分离效果良好.

2.2 流动相的选择

为使各组分基本分离、且达到预期效果，流动相应具备能改善待测物质的响应、有效提高灵敏度的性质.组分在色谱柱上的吸附与有机改性剂的种类和比例有很大关系.实验分别考察了甲醇和乙腈对分离效果的影响，结果表明乙腈的洗脱能力更优，故选择乙腈.邻位香兰素、乙基香兰素和香兰素中均含有酚羟基，显酸性.在酸性化合物的色谱分离中，对于色谱峰的拖尾现象或化合物解离现象一般加入酸性添加剂来优化，使保留增强.又考虑到酸性添加剂的酸性过强会对色谱柱进行损坏，故选醋酸铵溶液作为酸性添加剂.分别以乙腈-醋酸铵溶液(浓度为0.02 mol/L)体积比为2∶8、3∶7和4∶6作为流动相进行实验，当流动相为乙腈-醋酸铵溶液(浓度为0.02 mol/L)体积比为3∶7时，邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素的保留时间分别为12.00、10.20、9.82和6.00 min，分离效果好，峰形对称，响应值高.

在上述优化的色谱条件下，混合对照品和实际样品的色谱图如图1所示，在15 min内可以将邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素进行分离.且可以看出实验选择的色谱条件适用于这4种物质的分离及分析.

图1 混合对照品与实际样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and actual sample

2.3 方法的线性关系

分别配制不同质量浓度的混合标准工作溶液，在上述色谱条件下，对标准工作曲线进行测定，得到4种化合物的线性范围、线性相关系数及回归方程，在3倍信噪比的进样浓度水平下计算出检出限，结果如表1所示.

表1 邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素的线性范围、线性方程、相关系数及检出限Table 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients and detection limits ofo-vanillin,methyl vanillin,ethyl vanillin and vanillin

2.4 方法的回收率与精密度

分别在邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素工作溶液中加入高、低2种质量浓度的混合标准溶液进行加标回收实验，平行测定6份，考察方法的加标回收率和精密度，结果见表2.结果表明此方法具有较高的检测精密度及准确度.

表2 邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素的加标回收率及精密度Table 2 Recovery and precision of o-vanillin,methyl vanillin,ethyl vanillin and vanillin

2.5 实际样品分析

精密称取适量经前处理过的邻位香兰素原料，用乙腈溶解，按照色谱条件测定其质量浓度，共测定4批，结果见表3.结果表明本方法对于实际样品中邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素的测定具有准确性.

表3 邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素及 香兰素的实际样品分析Table 3 Contents of o-vanillin,methyl vanillin,ethyl vanillin and vanillin in real o-vanillin samples

3 结 论

建立了同时测定邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香兰素含量的高效液相色谱法，通过对线性范围、检出限、回收率、精密度等的考察，确定该方法具有操作方便简单、测试高效、结果准确等优点，能够在实际样品测定中得到较为准确的结果.该方法第一次建立了同时测定邻位香兰素工业原料中各物质含量的高效液相色谱法，有利于优化邻位香兰素的质量监控过程，为药品的质量和人体的健康提供技术支持.