HPLC法测定卡巴他赛的有关物质

赵迎春，韩继永



HPLC法测定卡巴他赛的有关物质

赵迎春1，韩继永2

（1. 江苏省徐州医药高等职业学校，江苏 徐州 221116； 2. 江苏奥赛康药业股份有限公司, 江苏 南京 211112）

：建立卡巴他赛的有关物质测定法。：以Shimpack VP-ODS为色谱柱；以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(20:30:50)为流动相A，以甲醇-乙腈（40：60）为流动相B，线性梯度洗脱0～25 min，流动相B 20%~30%；25～40 min，流动相B 30%~80%；40～50 min，流动相B 80%；50～60 min，流动相B 80%~20%）；流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为230 nm。：各已知杂质在0.05~5.0 g/mL范围为线性关系良好（≥0.999），各杂质与主峰的分离度良好；溶液在8小时内稳定性良好，精密度和重复性RSD均小于5.0%；各已知杂质的回收率均在95.42%~108.6%的范围内，RSD均小于3.42%（= 9）。：本法简便、快速、准确、灵敏，适用于卡巴他赛的有关物质测定。

高效液相色谱法(HPLC)；卡巴他赛；有关物质

前列腺癌是男性常见恶性肿瘤，常发病于老年男性，在美国是除在皮肤癌之外第二大常见男性癌症。据疾病防控中心最近统计报道，2006年约有203 415名男性罹患前列腺癌，其中28 372人死亡。卡巴他赛（Cabazitaxel）是一种微管抑制剂，适用于联合泼尼松治疗，做为二线治疗药，对已接受过多西他赛治疗的激素难治性转移性前列腺癌（MHRPC）患者。2010年6月，美国FDA经优先审批程序批准了Sanofi-Aventis公司开发的卡巴他赛注射液上市，商品名为Jevtana，用于治疗男性前列腺癌，被推荐在使用常用晚期前列腺癌药物多烯紫杉醇，无效甚至病情加重时，首选的用于治疗晚期、抗激素型前列腺癌的药物[1]。本品的研究，有利于卡巴他赛在国内的推广，为患者提供更多的治疗机会。

卡巴他赛为半合成化合物，其杂质的种类非常复杂，检测难度较大。经文献检索，对卡巴他赛有关物质检测方法的报导极少，有个别文章作了报导，但对已知杂质的研究不够深入[2-4]，笔者通过自行摸索，建立了卡巴他赛有关物质的测定方法，以便进行产品质量评价。

1 仪器与试药

Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Seven-Muti S40精密pH计（梅特勒-托利多公司）；BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）、KH-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

卡巴他赛对照品，批号：S12102101，自制。卡巴他赛原料：批号：121101，121102，121201，自制；杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质K、杂质L、杂质N、杂质O、杂质P，为卡巴他赛合成起始物料、副产物及中间体，自制。甲醇、乙腈均为色谱级，磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shimpack VP-ODS，250 mm×4.6 mm，5 m；以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶30∶50)为流动相A，以甲醇-乙腈（40∶60）为流动相B；线性梯度洗脱（0～25 min，流动相B 20%~30%；25～40 min，流动相B 30%~80%；40～50 min，流动相B 80%；50～60 min，流动相B 80%~20%）；流速为1.0 mL/min ；柱温为25 ℃；检测波长为230 nm。

2.2 系统适用性试验

取卡巴他赛对照品和各杂质对照品适量，分别加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中约含各杂质0.25 mg、含卡巴他赛2.5 mg的溶液，作为贮备液。分别取上述贮备液各1 mL混匀，精密量取上述溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，卡巴他赛与各杂质间的分离度良好，见图1。

2.3 方法专属性考察

精密称取本品约10 mg，共5份，置20 mL量瓶中，分别加1 mol/L盐酸溶液2 mL，放置4 h；加30%的过氧化氢溶液2 mL，放置4 h；加甲醇2 mL使溶解，在强光4 500 LX下照射4 h；加甲醇2 mL使溶解，并在100 ℃水浴中加热4 h；加0.1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，放置5 min；上述溶液分别用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述破坏后的供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，考察降解产物的分离度情况，本品在光照、氧化、高温、酸性条件下均无明显破坏。在碱性溶液中极易被破坏，产生一个较大的杂质，经过确证为杂质A。各条件下产生的降解产物与主峰的分离良好。采用二极管阵列检测器进行峰纯度检测，结果表明各破坏条件下主峰的纯度因子均大于0.999。因此，可以推测杂质A为卡巴他赛的主要降解产物。

图1 系统适用性试验色谱图

1-杂质A；2-杂质G；3-杂质L；4-杂质C；5-杂质B；6-卡巴他赛；7-杂质J；8-杂质D；9-杂质O；10-杂质F；11-杂质E；12-杂质P；13-杂质K；14-杂质N。

2.4 线性关系考察

取上述各已知杂质对照品和卡巴他赛对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成0.05~5.0μg/mL的系列对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以卡巴他赛和杂质A浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，分别进行线性回归，得回归方程，并计算各杂质相对卡巴他赛的校正因子，结果见表1。

结果表明，本品各已知杂质在0.05~5.0μg/mL的范围内，线性良好。部分已知杂质的校正因子在0.9~1.1范围之外，采用自身对照法计算有关物质时，需要加校正因子进行校正。

2.5 精密度试验

取本品适量，加甲醇溶解并稀释制成0.5 mg/mL的溶液，精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，连续进样5次，以峰面积计算，主峰面积RSD为0.04%（=5），各杂质峰面积的RSD均小于5.0%，表明本法精密度良好。

表1 各已知杂质的线性范围及校正因子研究

2.6 重复性试验

取本品（批号：121101），加甲醇溶解并稀释制成0.5 mg/mL的溶液，作为供试品溶液，精密量取1 mL置100 mL量瓶中，作为对照溶液。平行配制6份溶液，分别精密量取供试品溶液和对照溶液各20mL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法计算各杂质的含量（杂质A、杂质E、杂质F、杂质L、杂质O和杂质P的含量分别乘以相应的校正因子），结果表明，杂质G含量为0.06%，其他已知杂质均未检出，其他最大单一杂质为0.05%，总杂质含量为0.23%；各杂质RSD均小于5.0%，本法的重复性良好。

2.7 溶液稳定性试验

取本品（批号：121101）适量，按“2.6”项下方法制成供试品溶液和对照溶液，分别于0、1、2、4、6、8 h精密量取20mL，注入液相色谱仪，考察溶液的稳定性。结果表明，供试品溶液主峰面积的RSD为0.54%（= 6），对照溶液主峰面积RSD为0.11%（= 6），杂质个数及总量未见增加，表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.8 回收率试验

称取卡巴他赛原料50 mg，平行9份，平均分为三组，分别置100 mL量瓶中，精密加入各已知杂质对照品适量，使供试品溶液中含各已知杂质的含量分别为0.05%、0.10%和0.15%，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别精密量取供试品溶液和对照溶液各20mL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按加校正因子的自身对照法计算各杂质的含量，计算回收率，结果各已知杂质回收率范围均在95.42%~108.6%的范围内，RSD均小于3.42%（= 9），表明本法的准确度良好，见表2。

2.9 灵敏度试验

取卡巴他赛和已知杂质对照品溶液，加甲醇溶解并逐级稀释后进行测定，按信噪比10∶1为定量限，3∶1为检测限，结果表明卡巴他赛的定量限为0.32 ng，检测限为0.10 ng，已知杂质的定量限及检测限见表2，各杂质的检测灵敏度符合要求。

表2 回收率试验和灵敏度试验结果

2.10 样品测定

取卡巴他赛适量，按“2.1”项下色谱条件和“2.6”项下方法操作，测定样品中有关物质的含量，结果见表3，图2。

表3 样品有关物质测定结果

2.11 结论

以上研究表明，本检查法专属性强，精密度、重复性好，准确度及灵敏度高，适用于本品的有关物质检测。

3 讨论

（1）卡巴他赛为半合成化合物，起始原料为10-DAB衍生物为天然提取物的半合成品，且在合成过程中存在较多的副反应，因此本品中存在的结构类似的杂质种类较多，很难在色谱柱上达到基线分离。经过摸索，我们采用梯度系统法，可改善各杂质间的分离度效果。

图2 样品的有关物质检测色谱图

1-空白溶剂；2-批号：121101；3-批号：121102；4-批号：121201

（2）经过检测，本公司的卡巴他赛的合成工艺可有效去除起始物料及中间体，且破坏性试验表明，本品的主要降解产物为杂质A，部分产品中检测出杂质E和杂质G，因此建议将杂质A、杂质E和杂质G作为关键杂质订入标准。

（3）本文对卡巴他赛的起始物料、中间体及副产物能达到理想的分离效果，且国内尚无对本品已知杂质的检测方法进行深入研究的报导，本文对卡巴他赛的产业化推广具有积极意义。

［1］马培奇.美FDA批准卡巴他赛二线治疗转移性激素不应性前列腺癌[J].上海医药,2010,31(11):509．

［2］Peter de Bruijn, Anne-Joy M. de Graan, Annemieke Nieuweboer,et. Quantification of cabazitaxel in human plasma by liquid chromatography /triple-quadrupole mass spectrometry: A practical solution non-specific binding. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis [J]. 59 (2012) 117-122．

［3］A. Kort, M.J.X. Hillebrand, G.A. Cirkel,et.Quantification of cabazitaxel, its metabolite docetaxel and the determination of the demethylated metabolites RPR112698 and RPR123142 as docetaxel equivalents in human plasma by liquid Chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B[J] .925 (2013) 117-123．

［4］李明玥. 卡巴他赛有关物质检验方法筛选[J]. 医药论坛, 2016, 4:187-188.

Determination of Related Substances in Cabazitaxel by HPLC

1,2

（1. Jiangsu Provincial Xuzhou Pharmaceutical Vocational College, Jiangsu Xuzhou 221116, China；2. Jiangsu Aosaikang Pharmaceutical Co.,Ltd.,Jiangsu Nanjing 211112, China）

: To establish a method for determination of the related substances in Cabazitaxel.:The column was Shimpack VP-ODS, with the mobile phase A of methanol- acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution (20:30:50),and the mobile phase B of methanol- acetonitrile（40：60）.The linearity gradient elution: 0-25 min，mobile B 20%~30%；25-40 min，mobile B 30%~80%；40-50min,mobile B 80%；50-60 min,mobile B 80%~20%.The flow rate was 1.0mL/min, the column temperature was 25 ℃, the detection wavelength was 230 nm.: The liner range of calibration curve for related substances was 0.05~5.0 g/mL(≥ 0.999),the resolution was good between degradation and Cabazitaxel,and the solution was stable within 8 h,and the RSDs of precision and repeatability were less than 5.0%(= 6),the recovery of related substances was 86.04%~118.9% (RSD<8.4%,= 9).: The method is simple, rapid, accurate, sensitive, and suitable for determination of the related substances in Cabazitaxel..

high performance liquid chromatography (HPLC) ; Cabazitaxel; related substances

2017-12-01

赵迎春（1979-），女，讲师，工学硕士，江苏省徐州市人，2009年毕业于南京工业大学生物化工专业，研究方向：药学。

O 652

A

1004-0935（2017）12-1225-04