GSK-3β抑制剂在七氟醚诱发老年大鼠海马神经元凋亡中的作用

蒋仁江，王雨薇，张加强

1. 河南省焦作煤业(集团)有限公司中央医院(焦作 454000)；2. 河南省焦作市人民医院(焦作 454000)；3. 河南省人民医院(郑州 450003)

GSK-3β抑制剂在七氟醚诱发老年大鼠海马神经元凋亡中的作用

*蒋仁江1，王雨薇2，张加强3

1. 河南省焦作煤业(集团)有限公司中央医院(焦作 454000)；2. 河南省焦作市人民医院(焦作 454000)；3. 河南省人民医院(郑州 450003)

目的 探讨GSK-3β抑制剂在七氟醚诱发老年大鼠海马神经元凋亡中的作用。方法 54只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=18)、七氟醚组(n=18)和GSK-3β抑制剂组(n=18)，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠分别经尾静脉注射生理盐水15 mL和GSK-3β抑制剂15 mg/kg，连续吸入七氟醚4 h，假手术组大鼠经尾静脉注射生理盐水15 mL，连续吸入氧气和氮气(1∶1)混合气体4 h。每组各取6只大鼠，分别于麻醉前30 min(T0)、麻醉后1、2、3、4 d，利用Morris水迷宫实验评估大鼠认知功能，分别于麻醉前30 min、麻醉后1 d和5 d，检测海马组织中神经元凋亡情况，利用Western blot法检测海马组织中caspase-3、GSK-3β和p-GSK-3β表达。结果 与假手术组相比，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d和2 d时逃避潜伏期均延长，穿越平台次数减少，原平台所在象限停留时间缩短，与七氟醚组相比，GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d和2 d时逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，原平台所在象限停留时间延长；与假手术组相比，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d时神经元凋亡率、caspase-3蛋白、GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表达量均升高，与七氟醚组相比，GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d时神经元凋亡率、caspase-3蛋白、GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表达量均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 GSK-3β参与了七氟醚诱发老年大鼠海马神经元凋亡，抑制GSK-3β蛋白活化可减少神经元凋亡发生。

老年大鼠；七氟醚；GSK-3β抑制剂；神经元凋亡

术后认知功能障碍(postoperation cognitive dysfunction，POCD)作为老年患者术后常见严重并发症[1]，严重影响患者术后恢复。海马作为学习、记忆功能的重要调控区域，其神经元在氧化应激、炎症反应等因素刺激下发生凋亡是导致认知功能障碍的重要机制[2]。七氟醚是临床常用的吸入性全麻药，可导致患者发生POCD[3]，研究[4]表明，七氟醚所致POCD与海马神经元凋亡密切相关。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，可通过诱导tau蛋白过度磷酸化，从而导致海马神经元损伤和凋亡[5]，氯化锂作为GSK-3β的抑制剂，可减少GSK-3β所致神经元凋亡[6]。本研究拟对GSK-3β抑制剂氯化锂对七氟醚诱发老年大鼠海马神经元凋亡的影响进行分析，并探讨可能的机制，以期为临床实践提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠54只，18～20月龄，体质量450～600 g，由河南省实验动物中心提供，饲养于安静环境中，自由进食、进水。利用随机数字表进行随机化分组：假手术组(n=18)、七氟醚组(n=18)和GSK-3β抑制剂组(n=18)。

1.1.2 主要试剂和仪器 七氟醚购自上海恒瑞医药有限公司(批号：国药准字H20070172)，GSK-3β抑制剂购自美国Sigma公司， Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司，鼠抗GSK-3β、p-GSK-3β单克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司，抗caspase-3单克隆抗体购自艾美捷科技有限公司，Morris水迷宫行为检测系统购自上海欣软信息科技有限公司，麻醉气体监测仪购自美国Datex-Ohmeda公司，流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 假手术组和七氟醚组大鼠分别经尾静脉注射生理盐水15 mL，GSK-3β抑制剂组大鼠则经尾静脉注射GSK-3β抑制剂15 mg/kg，放置在铺有少量钠石灰的有机玻璃麻醉箱中，箱体左右两侧各留有一小圆孔。七氟醚组和GSK-3β抑制剂组一端连接七氟醚挥发罐，连续输入七氟醚4 h， 另一端作为出气孔，连接麻醉气体监测仪，对七氟醚、氧气及二氧化碳浓度进行监测，通气流量2 L/min； 假手术组则连续输入氧气和氮气(1∶1)混合气体4 h，通气流量2 L/min。

1.2.2 Morris水迷宫实验 每组各取6只大鼠，分别于麻醉前30 min(T0)、麻醉后1、2、3、4 d，利用Morris水迷宫实验评估各组大鼠认知功能。定位航行实验：将大鼠从不同象限头朝池壁放入水池中，记录大鼠每次找到平台的时间作为逃避潜伏期，取均值，连续进行4 d，若60 s内大鼠未找到平台，则将大鼠引导到平台上停留15 s，逃避潜伏期记为60 s。 空间探索实验：第5天时将平台撤去，从任一象限将大鼠朝池壁放入，记录其60 s内穿越平台次数，以及在平台所在象限停留时间。

1.2.3 利用流式细胞技术检测海马组织中神经元凋亡情况 于麻醉前30 min各组取6只大鼠，麻醉后1 d各组取6只大鼠，以及麻醉后5 d Morris水迷宫实验后各组取6只大鼠，利用戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉处死后，留取海马组织，保存于液氮中以备检。取海马组织1 g，研磨后制备细胞悬液，于1 500 r/min离心5 min，留取沉淀，将缓冲液加入，制备单细胞悬液(浓度1×105～5×105个/mL)，分别将Annexin V和PI加入后，避光孵育5 min，利用流式细胞仪进行检测，以荧光强度反映神经元凋亡率。

1.2.4 Western blot法检测海马组织中caspase-3、GSK-3β、p-GSK-3β表达 取海马组织1 g研磨后，加入蛋白裂解液裂解，4 ℃条件下匀浆离心，取上清，用总蛋白检测试剂盒对总蛋白含量进行检测。行SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜后，用含5%脱脂奶粉的PBST于室温条件下封闭30 min，用PBST液洗涤3次，分别将一抗caspase-3单克隆抗体、鼠抗GSK-3β、p-GSK-3β单克隆抗体(稀释浓度分别为1∶1 000、 1∶800和1∶500)，4 ℃过夜孵育，用PBST冲洗3次，将HRP标记的山羊抗大鼠二抗(1∶1 500稀释)加入，室温下摇动60 min，用PBST洗膜，用ECL化学发光试剂盒进行发光反应，曝光显像后，用Image J软件对图像进行分析，以β-actin为内参，用相对灰度比值表示目的蛋白表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Morris水迷宫实验结果

与麻醉前30 min相比，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d和2 d时逃避潜伏期均延长，差异均有统计学意义(P<0.05)；与假手术组相比，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d和2 d时逃避潜伏期均延长，穿越平台次数减少，原平台所在象限停留时间缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)；与七氟醚组相比，GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d和2 d时逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，原平台所在象限停留时间延长，差异均有统计学意义(P<0.05)(表1和表2)。

表1 3组大鼠穿越平台次数和原平台所在象限停留时间比较(n=6，±s)

注：与假手术组相比，aP<0.05；与七氟醚组相比，bP<0.05

2.2 3组大鼠不同时点神经元凋亡率和海马组织中相关蛋白表达比较

与麻醉前30 min相比，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d神经元凋亡率、caspase-3蛋白、GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表达量均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与假手术组相比，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d神经元凋亡率、caspase-3蛋白、GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表达量均升高，但与七氟醚组相比，GSK-3β抑制剂组升高的幅度低，差异均有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表2 3组大鼠逃避潜伏期比较

注：与麻醉前30 min相比，aP<0.05；与假手术组相比，bP<0.05；与七氟醚组相比，cP<0.05

表3 3组大鼠不同时点神经元凋亡率和海马组织中相关蛋白表达比较±s)

注：与麻醉前30 min相比，aP<0.05；同一时点与假手术组相比，bP<0.05；同一时点与七氟醚组相比，cP<0.05

3 讨论

POCD是老年全麻手术患者术后常见中枢系统并发症，患者主要表现为记忆力、精神集中能力和定向力等多方面的可逆性障碍，亦有少数患者出现不可逆性损伤[7]。目前，POCD具体发生机制尚未明确，有研究[8]表明，全麻药物、手术应激等均可诱发脑组织炎症反应，释放的炎症因子可影响神经元功能并诱导其凋亡，与POCD发生密切相关。GSK-3作为具有多种功能的丝/苏氨酸蛋白激酶，参与多种生理功能，GSK-3β是其重要亚型，在细胞凋亡中发挥重要作用[9]。氯化锂作为GSK-3β抑制剂，被应用于神经退行性疾病的治疗中，可通过抑制GSK-3β活性而减少神经元凋亡，促进神经再生[10]。本研究为进一步探讨GSK-3β抑制剂对POCD发生的影响，结合文献[11]，采取吸入七氟醚4 h的方式制备POCD模型，并结合文献[12]和预实验，采取经尾静脉注射GSK-3β抑制剂15 mg/kg的方式进行干预，Morris水迷宫实验结果显示，与假手术组相比，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d和2 d时逃避潜伏期均延长，穿越平台次数减少，原平台所在象限停留时间缩短，提示老年大鼠吸入七氟醚4 h后发生了POCD。

本研究显示，与七氟醚组相比，GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d和2 d时逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，原平台所在象限停留时间延长，说明使用GSK-3β抑制剂干预后，可显著改善大鼠认知功能。本研究显示，与假手术组相比，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d时神经元凋亡率、caspase-3蛋白表达量均升高，但相比七氟醚组，GSK-3β抑制剂组升高的幅度低，说明七氟醚所致POCD与凋亡执行蛋白caspase-3被活化，以及神经元细胞大量凋亡有关，而GSK-3β抑制剂干预则可抑制caspase-3蛋白活化，减少神经元细胞凋亡发生。本研究显示，与假手术组相比，七氟醚组和GSK-3β抑制剂组大鼠麻醉后1 d时GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表达量均升高，但相比七氟醚组，GSK-3β抑制剂组升高的幅度低，说明七氟醚吸入后发生POCD可能与GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白活化有关，研究[13]表明，活化的GSK-3β可通过激活NF-κB而促进促炎因子合成及释放，炎性反应可进一步促进tau蛋白磷酸化而诱导神经元细胞凋亡。而加入GSK-3β抑制剂进行干预后，则可抑制GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白活性，减少炎症反应，降低tau蛋白磷酸化程度，从而有效保护了神经元细胞。

综上所述，GSK-3β参与了七氟醚诱发老年大鼠海马神经元凋亡，其抑制剂可通过抑制GSK-3β蛋白活化而减少神经元凋亡的发生。

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The Role of GSK-3β Inhibitor in the Sevoflurane Anesthesia-induced Apoptosis of Aged Rats′ Hippocampal Neurons

JiangRenjiang1,WangYuwei2,ZhangJiaqiang3.

1.TheCentralHospitalofJiaozuoCoalGroupCo.,LTD,Jiaozuo454000,China; 2.ThePeople′sHospitalofJiaozuoCity,Jiaozuo454000,China; 3.HenanProvincialPeople′sHospital,Zhengzhou450003,China

Objective To investigate the role of GSK-3β inhibitor in the sevoflurane anesthesia-induced apoptosis of aged rats′ hippocampal neurons. Methods 54 healthy male SD rats were divided randomly into the sham operation group (n=18), sevoflurane group (n=18) and GSK-3β inhibitor group (n=18). The rats in the sevoflurane and GSK-3β inhibitor group were injected with 15mL saline and GSK-3β inhibitor 15mg/kg via the tail vein respectively and inhaled sevoflurane continuously for 4 hours. The rats in the sham operation group were injected with 15mL saline via the tail vein and inhaled the mixed gas of oxygen and nitrogen (1∶1) continuously for 4 hours. Six rats were selected from each group and their cognitive function were assessed via Morris water maze test 30 minutes before anesthesia, and 1 day, 2, 3 and 4 days after anesthesia respectively. The apoptosis in hippocampal neurons were detected and the expressions of caspase-3, GSK-3β, p-GSK-3β proteins in hippocampus were tested by Western blot analysis 30 minutes before anesthesia, and 1 day and 5 days after anesthesia respectively. Results Compared with the sham operation group, the escape latencies 1 day and 2 days after anesthesia in the sevoflurane group and GSK-3β inhibitor group were prolonged, the times of crossing platforms were reduced, and the residence time in the quadrant of the former platform were shortened. Compared with the sevoflurane group, the escape latencies after 1-day and 2-day anesthesia in the GSK-3β inhibitor group were shortened, the numbers of crossing platforms were increased, and the residence time in the quadrant of the former platform were prolonged. Compared with the sham operation group, the apoptosis rates and the expression levels of caspase-3 protein, GSK-3β protein and p-GSK-3β protein after 1-day and 2 day anesthesia in the sevoflurane group and GSK-3β inhibitor group were increased. Compared with the sevoflurane group, the apoptosis rates and the expression levels of caspase-3 protein, GSK-3β protein and p-GSK-3β protein after 1-day anesthesia in the GSK-3β inhibitor group were decreased, the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion GSK-3β is involved in the sevoflurane anesthesia-induced apoptosis of aged rats′ hippocampal neurons, therefore, the inhibition of GSK-3β protein activator could reduce the neuronal apoptosis.

Aged rats; Sevoflurane; GSK-3β inhibitor; Neuronal apoptosis

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170111.1045.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.003

河南省2015年科技发展计划(No：152300410163)

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A