基于AQP-4、P-gp黄芩苷、栀子苷配伍对缺血/再灌注损伤大鼠血脑屏障保护机制研究

李 敏，王 斌，曹 慧, 武 璞,沈 甜,宋亚刚, 翟小虎，侯建平

(陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046)

基于AQP-4、P-gp黄芩苷、栀子苷配伍对缺血/再灌注损伤大鼠血脑屏障保护机制研究

李 敏，王 斌，曹 慧, 武 璞,沈 甜,宋亚刚, 翟小虎，侯建平

(陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046)

课题组前期发现，黄芩苷、栀子苷(7 ∶3)配伍具有抗脑缺血作用[1-2]。本实验进一步考察黄芩苷、栀子苷 (7:3) 配伍对脑缺血/再灌注损伤大鼠AQP-4、P-gp影响，探讨黄芩苷、栀子苷配伍对脑缺血/再灌注损伤的血脑屏障通透性和脑水肿的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 黄芩苷(陕西中鑫生物技术有限公司，批号140821); 栀子苷(陕西维奥生物技术有限公司,批号140912)。氯丙烯(上海兴光化学有限公司)；伊文斯兰(美国Sigma公司)； P-gp、Na+、K+-ATP酶Elisa试剂盒(南京建成生物工程研究所)，葡萄糖、丙酮酸和乳酸生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)，AQP-4 一抗体，二抗(Chemicon公司，批号：BA1560)。

1.2 仪器 酶标仪(美国Bio-TEK公司)等。

1.3 动物分组与给药 SD大鼠，♂，体质量280～320 g，[第四军医大学医院实验动物中心，合格证号SCXK-(军)2012-0007]。大鼠随机分为假手术组、模型组、栀子苷+黄芩苷大、小剂量组(18+42) mg·kg-1、(9+21) mg·kg-1，氯丙烯组(1 g·L-1)，假手术组和模型对照组给予等体积的4%的吐温溶液，其余各组药物用 4% 的吐温溶解灌胃给药，连续7 d。

1.4 脑缺血/再灌注损伤模型建立 末次给药30 min以后，采用线拴法复制大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型(MCAO)[3]。

1.5 指标测定

1.5.1 脑含水量测定 大鼠再灌注24 h断头取脑，从损伤区前缘取200 mg左右脑组织，计算脑水含量/%=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5.2 脑组织中的EB水平检测 参照文献[4]，脑缺血/再灌注损伤大鼠尾静脉注射EB-PBS液，检测脑组织中的EB水平。

1.5.3 脑组织中P-gp含量和Na+、K+-ATP酶活力测定 大鼠于缺血2 h/再灌22 h后断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，将患侧大脑在冰上按1 ∶9生理盐水制成10%的组织匀浆，离心后取上清液，按照试剂盒说明书测定。

1.5.4 血清葡萄糖、丙酮酸和乳酸含量测定 脑缺血/再灌注损伤大鼠于缺血2 h/再灌22 h后，取血清，按试剂盒说明书操作。

1.5.5 脑组织切片制备及HE染色 缺血2 h/再灌注22 h，麻醉并4%多聚甲醛大鼠，取脑，固定、石蜡包埋，HE染色。

1.5.6 脑组织内AQP-4 表达的检测 应用免疫组织化学染色检测脑组织中不同部位AQP-4蛋白的表达。假手术组脑组织作为对照。阳性部位为细胞膜，棕黄色为阳性表达。

2 结果

脑缺血模型组脑含水量、Na+，K+-ATP酶活力、EB、葡萄糖、丙酮酸、乳酸、P-gp含量明显升高(P<0.01，P<0.05)，同时缺血大脑皮层AQP-4阳性表达增强；病理结果显示模型组缺血区出现形态结构不清、血管腔受压变形、组织疏松、细胞体积增大及明显水肿，细胞空泡样变，神经元胞核破碎、结构消失。黄芩苷、栀子苷配伍能明显降低脑含水量、Na+，K+-ATP酶活力、EB、葡萄糖、丙酮酸、P-gp含量(P<0.05)，下调AQP-4表达，并能明显改善脑组织损伤。结果见Tab 1～3。

GroupDose/mg·kg-1EBcontent/μg·g-1Cerebralwatercontent/%Sham13.05±1.58**30±20*Model16.20±1.3460±60Baicalin+Geniposides21+913.78±3.3650±2042+1813.23±2.23*40±10*Chloropropene0.2013.94±1.43*50±10

*P<0.05，**P<0.01vsmodel

GroupDose/mg·kg-1P-gp/mg·g-1Na+,K+-ATP/10U·g-1Sham7.53±2.86*1.15±0.25*Model11.74±2.460.66±0.31Baicalin+Geniposides21+98.46±2.28*0.95±0.2442+188.09±1.67**1.03±0.19*Chloropropene0.208.23±2.26*0.98±0.19*

*P<0.05，**P<0.01vsmodel

GroupDose/mg·kg-1Glucose/mmol·L-1Pyruvicacid/mmol·L-1Lacticacid/mmol·L-1Sham6.88±1.58*0.29±0.07**31.04±10.04*Model11.22±3.910.53±0.1548.26±17.17Baicalin+Geniposides21+98.30±2.230.35±0.09*37.09±12.4242+187.50±1.68*0.31±0.12*33.50±10.39Chloropropene0.207.57±1.89*0.36±0.10*38.00±11.70

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3 讨论

已知AQP-4升高星形胶质细胞足突肿胀，血脑屏障通透性增加，促发明显的脑水肿和梗死[5]。P-gp是血脑屏障处重要的药物转运蛋白，脑缺血时，P-gp表达明显增加，增加BBB通透性[6]。脑组织缺血缺氧时，葡萄糖进行无氧酵解，乳酸增多，细胞膜上Na+，K+-ATP酶活性降低，细胞内液呈高渗状态，产生细胞毒性脑水肿。课题组发现黄芩苷、栀子苷配伍具有防治脑缺血/再灌注疗效[7]。本实验探讨黄芩苷、栀子苷配伍对CIRI后P-gp、葡萄糖无氧酵解及AQP-4蛋白表达的影响，阐释其降低BBB通透性，发挥防治脑水肿的作用机制。

脑缺血模型组大鼠脑含水量、EB通过量、P-gp含量、AQP-4蛋白表达明显升高，显示出缺血性损伤BBB通透性明显增强；缺血区细胞形态不清，有细胞体积增大、水肿，神经元胞核破碎、结构消失；Na+，K+-ATP酶活力降低、葡萄糖、丙酮酸及乳酸含量升高，显示出脑缺血损失时，无氧呼吸明显增强，细胞毒性明显。可见，黄芩苷、栀子苷(7 ∶3)配伍可能通过提高Na+，K+-ATP酶活性，降低脑组织无氧呼吸，减轻细胞毒性；降低P-gp含量、AQP-4蛋白表达，改善BBB 通透性，减轻脑水肿损伤，从而起到防治脑缺血/再灌注损伤的作用。但其体内调控的机制仍需进一步深入研究。

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Effect of Baicalin and Geniposide on blood brain barrier permeability in cerebral ischemia reperfusion injury rats based on AQP-4, P-gp and its mechanism

LI Min，WANG Bin，CAO Hui, WU Pu, SHEN Tian, SONG Ya-gang, ZHAI Xiao-hu, HOU Jian-ping

(CollegeofPharmaceuticalScience,ShaanxiUniversityofChineseMedicine，XianyangShanxi712046,China)

黄芩苷+栀子苷; 脑缺血/再灌注损伤; 血脑屏障; 脑水肿；水通道蛋白；P-糖蛋白

Baicalin and Geniposide; cerebral ischemia reperfusion injury; BBB; brain edema；aquaporin-4(AQP-4); P-glycoprotein(P-gp)

时间：2017-3-4 11:51

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1151.058.html

2016-10-20,

2016-12-09

国家自然科学基金资助项目(No 81473385)；陕西省教育厅重点实验室项目(No 13JS029)；陕西省中管局项目(No 13-zy016)

李 敏(1978-)，女，博士，副教授，Tel:029-38185165,E-mail：liminsweet@126.com; 王 斌(1978-)，男，教授,通讯作者,E-mail：wangbin812@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.029

A

1001-1978(2017)03-0443-02

R-332；R284.1；R289.1；R322.81；R743.310.22；R743.310.531