针刺手厥阴经穴对心肌缺血再灌注损伤大鼠CRTmRNA表达率的影响*

田岳凤，袁 叶，王 军，李雷勇

(1．山西中医学院针灸推拿学院，太原 030024;2．山西中医学院附属医院，太原 030024; 3．山西医科大学第二医院，太原 030001)

针刺手厥阴经穴对心肌缺血再灌注损伤大鼠CRTmRNA表达率的影响*

田岳凤1，袁 叶2，王 军1，李雷勇3

(1．山西中医学院针灸推拿学院，太原 030024;2．山西中医学院附属医院，太原 030024; 3．山西医科大学第二医院，太原 030001)

目的:观察电针手厥阴经“内关”“郄门”穴对缺血再灌注损伤过程大鼠心肌组织CRTmRNA表达率的影响，探讨经穴与脏腑间的特异性联系。方法:50只Wistar大鼠根据随机数字表法分为假手术组、缺血-再灌注模型组、针刺“内关”治疗组、针刺“郄门”治疗组以及针刺“合谷”对照组5组各10只。除假手术组外，其他4组均制备缺血-再灌注动物模型，假手术组穿线但不结扎冠状动脉。“内关”、“郄门”、“合谷”3组穴位针刺20 min后，结扎冠状动脉左前降支40 min，再次针刺上述穴位20 min松扎，恢复冠脉灌流60 min后摘取心脏取心尖部组织，采用RT-PCR方法测定CRTmRNA表达率，实验过程中心电图(ECG)全程监测。结果:假手术组CRTmRNA的表达很低，模型组与“内关”组、“郄门”组比较，CRTmRNA表达率下降非常明显;模型组与“合谷”组比较，CRTmRNA表达率比较差异无统计学意义;“内关”组与“郄门”组比较差异无统计学意义。结论:针刺手厥阴经穴可有效促进CRTmRNA的表达，提高CRTmRNA的表达率，减轻胞浆钙超载对心肌细胞的损伤。

针刺;心肌缺血再灌注损伤;钙网蛋白;反转录聚合酶链式反应

心肌缺血再灌注损伤(I/R)在导致心肌细胞坏死的同时，促发凋亡细胞，凋亡的出现与Ca2+超载密切相关。我们以往的研究表明，针刺可明显降低心肌缺血再灌注损伤细胞内Ca2+超载的程度，抑制心肌细胞凋亡。而针刺在心肌细胞内Ca2+超载和细胞凋亡之间的影响及作用机制一直是我们思考的问题。本研究以往实验证实，针刺可明显提高血清CRT含量，促进CRT表达上调的基础上，通过RTPCR技术检测针刺手厥阴经穴对心肌缺血再灌注损伤CRTmRNA表达率的影响，试图阐明心包经和心之间的特异性联系，以丰富中医学经脉－脏腑相关理论的内涵。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

50只清洁级Wistar大鼠，体质量250 g～300 g，雌雄各半，由山西医科大学动物中心提供(许可证号SCXK(晋)2009-0001)。按随机数字表法分为假手术组、缺血-再灌注模型组、针刺“内关”治疗组、针刺“郄门”治疗组和针刺“合谷”对照组5组各10只。

1.2 干预方法

心肌缺血再灌注损伤模型制备方法采用我们长期使用经典模型［1］。除假手术组外，其他4组均制备缺血-再灌注动物模型，假手术组穿线但不结扎冠状动脉。“内关”“郄门”“合谷”3组穴位针刺20 min后，结扎冠状动脉左前降支40 min，再次针刺上述穴位20 min，松扎、恢复冠脉灌流60 min后，摘取心脏取心尖部组织，采用 RT-PCR方法测定CRTmRNA表达率。

1.3 仪器与试剂

采用ECG-6511心电图机将针形电极刺于动物皮下，接标准Ⅱ导联，每次记录5个心动周期，走纸速度50mm/s，灵敏度10mm/mv，以STⅡ段变化值(结扎后ST段电位值－结扎前ST段电位值)反映心肌缺血程度。记录结扎前、结扎后即刻、结扎后20 min、结扎后40 min、松扎后即刻、松扎后30 min、松扎后60 min 7个时间段S-T段的变化情况。

宁波新芝科器研究所JY92-2D超声波细胞粉碎机，德国Heraeus低温冷冻离心机，eppendorf PCR仪。TransGen Biotech提供 Trizol和 RT-PCR试剂盒。引物由上海生工设计，琼脂糖凝胶电泳用德国产UVP(紫外透射仪)凝胶成像系统上扫描，电泳条带用Photo shop7.0读取均值。

1.4 标本处理

取大鼠心脏左心室心尖部心肌组织10mm× 7mm×3mm大小，用生理盐水反复冲洗后滤纸吸尽组织表面水分，电子天平秤取质量，取100 mg心肌组织置于液氮罐中。

1.5 RT-PCR检测

两步法测定心肌组织CRT含量，对CRTmRNA进行相对定量分析。按照Trizol试剂盒说明进行，实验由山西医科大学实验中心检测完成。

观光农业以农业为基础，以旅游为手段，以城市为市场，以参与为特点，以文化为内涵，它的形式和类型很多，其中规模较大的主要有5种：观光农园、农业公园、教育农园、森林公园和民俗观光村。

经过PCR反应后在凝胶成像系统成像，采用图像识别分析系统(Photo shop7.0)扫描电泳条带的光密度。按照以下公式进行计算:RT-PCR产物比值=靶mRNA灰度值/内对照(GAPDHmRNA灰度值) ×100%。上述过程需重复3次取其平均数值。

1.6 统计学方法

采用SAS8.2统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ECG的变化

表1、2显示，冠状动脉左前降支未结扎，各组STⅡ比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结扎后20 min、40 min，各组STⅡ值较结扎前均有不同程度的提高。缺血再灌注模型组抬高明显，“内关”组、“郄门”组与模型组比较差异有统计学意义 (P＜0.01)，“合谷”组的变化趋势与模型组相近似，2组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。松扎后，抬高的ST段开始回落，30 min和60 min后“内关”组、“郄门”组STⅡ变化值与模型组、“合谷”组比较差异仍有统计学意义(P＜0.01)。

表1 各组动物缺血前STⅡ的比较(±s，mv)

表1 各组动物缺血前STⅡ的比较(±s，mv)

组别 例数 结扎前FP假 手 术 组10 0.043±0.031缺 血 -再 灌 注 模 型 组 10 0.036±0.021针 刺 “ 内 关 ” 组 10 0.042±0.040 0.68 ＞0.05针 刺 “ 郄 门 ” 组 10 0.037±0.017针 刺“合 谷 ”对 照 组10 0.036±0.025

表2 再灌注过程中STⅡ差值的变化(±s，min)

表2 再灌注过程中STⅡ差值的变化(±s，min)

注:与缺血-再灌注模型组比较:ΔΔP＜0.01;与针刺“合谷”对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 例 数 结扎后20ˊ 结扎后40ˊ 松扎后30ˊ 松扎后60ˊ缺血-再灌注模型组 10 0.310±0.045 0.312±0.044 0.274±0.037 0.0260±0.037针 刺“ 内 关 ”组 10 0.241±0.026ΔΔ＊＊ 0.249±0.034ΔΔ＊＊ 0.177±0.040ΔΔ＊＊ 0.163±0.041ΔΔ*针 刺“ 郄 门 ”组 10 0.226±0.040ΔΔ＊＊ 0.228±0.046ΔΔ＊＊ 0.159±0.039ΔΔ＊＊ 0.148±0.036ΔΔ*针刺“合谷”对照组 10 0.307±0.057 0.309±0.057 0.260±0.050 0.248±0.051 F 10.14 8.53 18.88 18.79 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 CRTmRNA表达率的变化

表 3图 1显示，假手术组大鼠心肌组织CRTmRNA的表达率很低，与模型组、“合谷”组比较差异显著(P＜0.05);模型组与“内关”治疗组、“郄门”治疗组比较，CRTmRNA表达率降低非常明显(P＜0.01);模型组与“合谷”对照组比较，CRTmRNA表达率差异无统计学意义(P＞0.05);“内关”组与“郄门”组差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

近年来研究发现，钙网蛋白(CRT)在缺血缺氧损伤中的作用非常重要，其过度的表达能够抑制肾小管上皮细胞内质网中Ca2+的释放，由此使得胞浆内的钙超载得以减轻［2］。在电诱导犬血栓模型上，冠脉灌流液中加入CRT可防止冠状动脉左旋支梗塞，显示钙网蛋白可能是通过诱导内皮细胞NO合成与释放来预防血栓形成的。徐菲菲等［3］研究发现，缺氧预处理24 h后心肌细胞内钙网蛋白的表达增加，表明其参与了预处理对心肌细胞的保护。

与上述研究相反，有报道人类胚胎肾细胞中过表达CRT，内质网释放Ca2+增多，活化钙调节磷酸酶，增加细胞凋亡的敏感性。还有学者报道大鼠H9c2成肌细胞过表达钙网蛋白，细胞数量减少，DNA双链断裂增加，易于发生凋亡;蛋白磷酸酶(PP2A)表达及活性上调，提示钙网蛋白的过表达，改变Ca2+稳态上调PP2A表达，促进细胞凋亡［4］。实验结果的不同是否与细胞类型的不同或是应激刺激的不同有关，需要进行深入的研究。

表3 各组大鼠心肌组织CRTmRNA表达率比较(±s，%)

表3 各组大鼠心肌组织CRTmRNA表达率比较(±s，%)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与缺血-再灌注模型组比较:△△P＜0.01

组别 例数 CRTmRN FP假 手 术 组8 0.560±0.095缺血-再灌注模型组 8 0.735±0.123*针 刺 “ 内 关 ”组 8 0.955±0.212＊＊△△15.10 ＜0.01针 刺 “ 郄 门 ”组 8 1.058±0.144＊＊△△针刺“合谷”对照组 8 0.776±0.100*

图1 内参基因(307bp)、CRT基因(197bp)RT-PCR扩增产物凝胶电泳图

RT-PCR方法是在蛋白质水平进行基因分析直观、特异的方法，它将特异性的免疫反应、可见的组织化学变化与具有显像、放大作用的显微镜相结合，简便、快速地对细胞因子的mRNA进行定性或定量分析［5］。

从RT-PCR实验结果可以看出，“内关”组、“郄门”组CRTmRNA表达率明显上调，较模型组及“合谷”组均有显著升高。此项指标的观察结果与血清CRT含量的变化及心肌组织CRT蛋白表达的变化相一致［5］，进一步说明经穴对靶器官的特异性调节作用。

大量研究证明，在缺血－再灌注前后给予预处理，可阻断细胞的坏死、凋亡过程，减轻缺血再灌注损伤［6］。本项的实验结果与相关文献报道的高表达钙网蛋白可对心肌细胞起到保护作用相吻合，反映了钙网蛋白的高表达对心肌细胞内Ca2+的调节作用，Ca2+超载的减轻可能是通过钙网蛋白表达的上调使得内质网Ca2+结合能力增强，由此起到了保护心肌细胞的作用。对于电针激发钙网蛋白参与细胞保护作用的相关机制我们会进一步研究。

［1］袁叶，田岳凤，王军，等．针刺手厥阴心包经穴对心肌缺血再灌注损伤大鼠钙网蛋白的影响［J］．中医杂志，2011，52(3): 227-230．

［2］XIA C M，CHEN J，WANG J，et al．Differential expressions of nNOS and iNOS in the rostral ventrolateral medulla induced by electroacupuncture in acute myocardial ischemia rats［J］．Acta Physiologica Sinica，2008，60(4):453-461．

［3］徐菲菲，刘秀华，祝筱梅．钙网蛋白参与缺氧预处理对氧化应激损伤大鼠成心肌H9C2细胞的保护作用［J］．中国病理生理杂志，2008，24(8):1457-1463．

［4］IHARA YS，URATA YS，GOTO SJ，et al．Role of calreticulin in the sensitivity of myocardiac H9c2 cells to oxidative stress caused by hydrogen peroxide．American Journal of Physiology［J］．Cell Physiology，2006，290(1):208-221．

［5］陈名红，陈毅坚，叶艳青，等．用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的影响因素［J］．贵州农业科学，2009，37(8):28-30．

［6］徐菲菲，刘秀华，张振英，等．低氧后处理诱导钙网蛋白表达上调的心肌保护机制［J］．生理学报，2009，61(1):35-42．

Effects of Electroacupuncture at the Points of the Pericardium Meridian in rate of Calreticulin Gene Expression in Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury

TIAN Yue-feng1，YUAN Ye2，WANG Jun1，LI Lei-yong3
(1．Department of Acupuncture＆Massage，Shanxi College of TCM，Taiyuan 030024，China; 2．The Affiliated Hospital of Shanxi College of TCM，Taiyuan 030024，China; 3．The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective:To investigate the effects of electroacupuncture(EA)of the points at the Pericardium Meridian of Hand-Jueyin on the changes of gene expression rates of CRTmRNA in myocardial ischemia and reperfusion injury rats so as to explore the specific relation between Meridian and Zangfu．Methods:Fifty Wistar rats anesthetized by 10%urethane were evenly randomized into sham，model，EA-“Neiguan”(PC6)，EA-“Ximen”(PC5)，EA-“Hegu”(LI4)groups．Under artificial respiration，MI/R model was established by ligation of the left descending anterior branch(DAB)of the coronary artery for 40 min，followed by reperfusion for 60 min．EA was applied to the above mentioned acupoints for 20 min，two times altogether．Then，the myocardial sample(below the ligationsite of DAB)of the left cardiac ventricle was taken for observing the changes gene expression of CRTmRNA．Results:The expression of sham group is less．Model group compared with“Neiguan”group，“Ximen”group，CRTmRNA expression is reduced very significant;model group compared with the“Hegu”group，CRTmRNA expression was no significant difference;between“Neiguan”and“Ximen”group there was not significantly different．Conclusions:The points of the Pericardium Meridian can obviously improve the gene expression rate of CRTmRNA，reduce injury caused by the calcium overload of myocardial cell．

Acupuncture;Myocardial ischemia/reperfusion injury;Calreticulin;RT-PCR

R246．9

B

1006-3250(2017)01-0105-03

2016-07-13

国家自然科学基金资助项目(30873240)-针刺对缺血再灌注损伤心肌细胞CaMKⅡ信号传递作用及Akt心肌保护作用的研究;山西省自然科学基金资助项目(2010011056-1)-针刺激活Akt信号通路对再灌注损伤心肌细胞凋亡干预机制的研究

田岳凤(1963-)，女，山西五台人，教授，博士研究生导师，从事穴位特异性研究。