冠心病血瘀证血管病变数与ACE基因多态性的相关性研究*

宋曙霞，李建军，刘 颖，罗有文，黄利英

(1．广东省妇幼保健院，广州 510000;2．中山大学孙逸仙纪念医院，广州 510000)

冠心病血瘀证血管病变数与ACE基因多态性的相关性研究*

宋曙霞1，李建军2△，刘 颖1，罗有文1，黄利英1

(1．广东省妇幼保健院，广州 510000;2．中山大学孙逸仙纪念医院，广州 510000)

目的:探讨冠心病血瘀证血管病变数与血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性的相关性。方法:运用聚合酶链反应(PCR)技术对119例冠心病血瘀证患者进行ACE基因检测，观察DD、DI、II基因型频率及等位基因频率。结果:冠心病血瘀证者ACE基因DD、I/D性患者血管狭窄支数较II型多。结论:冠心病血瘀证ACE基因DD、I/D型患者血瘀证严重。

冠心病;血瘀证;血管病变;血管紧张素转换酶基因(ACE基因);多态性

冠心病是最常见的心血管疾病，血瘀证是冠心病患者中最常见的中医证型。目前发现一些基因多态性影响脂质代谢、血栓形成、血管舒张、收缩等病理生理过程，与冠心病发生的危险性增加密切相关，其中以血管紧张素转换酶基因多态性研究较为深入［1］。国内外探讨ACE基因多态性与冠心病的研究比较深入，但探讨冠心病血瘀证与该基因多态性研究相对较少。本研究以冠心病血瘀证患者为研究对象，探讨冠心病血瘀证血管狭窄程度与ACE基因多态性的相关性，以期为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年6月至2011年3月119例广东籍中山大学附属第二医院门诊及住院的119例冠心病血瘀证患者，对入选者进行冠状动脉造影检查，根据检查结果分别对血管狭窄数为0、1、2、≥3的研究对象进行分组，各组别年龄、体质量、家族史等基线资料比较差异无统计学意义，具有可比性。抽取患者静脉血3 ml抗凝，充分混匀后放入－20℃冰箱冷藏室保存待检，对患者ACE基因型进行检查。

1.2 诊断标准

1.2.1 冠心病诊断标准 参照1979年世界卫生组织(WHO)制定的缺血性心肌病“心绞痛”“心肌梗死”的诊断标准［2］，以患者临床症状、体征和病史结合心电图改变或冠状动脉造影结果进行诊断。

1.2.2 中医证候诊断标准 参照文献标准［3］分为心血瘀证和非心血瘀证。血瘀证标准:舌质紫暗或舌体瘀斑、瘀点、舌下静脉曲张瘀血;固定性疼痛或绞痛，或者腹痛拒按;血不循经而停滞及出血后引起的血瘀、黑粪、皮下瘀斑;月经紊乱、经期腹痛、色黑有瘀斑、少腹急结等。

1.2.3 冠状动脉造影诊断标准 根据美国心脏协会的标准，冠状动脉狭窄程度以狭窄部位与临近正常管径减少百分比计算。直径狭窄＜50%为正常;50%～74%为轻度狭窄;75%～94%为中度狭窄;95%～99%为重度狭窄;100%为完全闭塞。有一处及以上狭窄程度50%为阳性。病变累计左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)和右冠状动脉(RCA)中的1支者为单支病变，2支者为2支病变，3支者为3支病变;左主干(LM)病变者，无论LAD或LCX有无病变者，均判定为2支病变。

1.3 主要试剂与仪器 Biometra T-Gradient PCR machine(PCR仪)，Biorad power FAQ200 elctrophoresis machine电泳仪，Shimadzu RNA/DNA纯度检测仪，BeckmanCoulterAllegraX -12R centrifuge(常温低速离心机)，Hettich Universal 32R Zentrifugen(台试低温高速离心机)，Uvidoc Uvitec BTX-20M(紫外观察暗箱)。试剂使用 Omega Company提供的 BLOOD DNA Kit提取DNA，按照DNA试剂盒提供的详细步骤提取DNA。引物设计Forwardprimer:CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT，Reverse primer:GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT。

1.4 PCR检测

1.4.1 PCR扩增 在冰上按下列顺序加入200ul的PCR管:5 μl模板DNA，1ul上游引物，1 μl下游引物，25 μl premer Taq(D331A)，再加入18 μl的双蒸水补足总体积为50 μl。PCR仪上94℃5 min初期变性，再94℃变性30 s，62℃复性30 s，72℃延伸1min，32个循环后72℃延伸10 min结束。

1.4.2 PCR鉴定 2%琼脂糖凝胶电泳，在每个孔中加入4 μlPCR反应产物，1 μl胶体金，1 μl 6 ×Loading Buffer混匀液，电泳，紫外灯检测。

1.5 统计学方法

ACE各基因型频率和等位基因频率经过Hardy Weinberg遗传平衡定律检验，用SPSS19.0软件进行统计，各组间频率比较用χ2检验，通过精确概率法分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电泳结果

图1显示，基因型判别:ACE基因上若存在I/D Alu序列，PCR产物490bp，即为插入型(I型);没有Alu序列，PCR产物为190bp，为缺失型(D)型;PCR产物为490bp，190bp即为I/D型，因此ACE基因型可分为II、I/D、DD 3种基因型。

2.2 冠心病血瘀证人群ACE基因频率分布

119例研究对象中，II型28例，ID型42例，DD型49例。3种基因型频率分别为41.2%、35.3%、23.2%。I、D等位基因分布频率为41.2%、51.8%，这些比例与Hardy Weinberg平衡一致，具有群体代表性。

2.3 冠心病血瘀证、非血瘀证患者血管狭窄数、支架数与ACE基因型分布

表1显示，冠心病血瘀证患者血管狭窄数与ACE基因DD、I/D、II型分布比较，DD、I/D型基因患者血管狭窄支数较 II型多(χ2=12．96，P＜0.05)。

表2显示，冠心病非血瘀证患者的血管狭窄数与ACE基因型比较差异无统计学意义(χ2=1.494， P=0.960＞0.05)。

2.5

表3显示，支架数与ACE基因型分布比较，冠心病血瘀证支架数与ACE基因DD、I/D、II型分布比较差异有统计学意义(χ2=13.826，P＜0．05)，随支架数的增多II基因型分布减少。

表1 冠心病血瘀证血管狭窄数与ACE基因型分布比较

表2 冠心病非血瘀证血管狭窄数与ACE基因型分布比较

表3 冠心病血瘀证心脏放支架数与ACE基因型分布比较

图1 冠心病血瘀证患者ACE基因型分布

3 讨论

人类ACE基因位于17号染色体长臂q23位点，长度是21 kb，包含26个外显子和25个内含子，其中第16内含子存在287bp DNA序列的插(I)或缺失(D)片段，构成ACE基因I/D多态性［4］。实验发现，DD(缺失)表型者血清ACE水平比II者(插入)高出2倍，I/D表型者ACE水平介于DD表型及II表型中间。Diamantopoulos等［5］发现，DD基因型携带者动脉粥样硬化形成危险因素高。Riera FortunyC［6］对欧洲南部冠心病患者研究表明，ACE基因型中DD、ID基因型与冠心病具相关性，携带D等位基因者，血清ACE基因集中较明显，这将增加血管紧张素II对血管的不利影响，也被认为是DD基因型增加了冠心病的风险。

血瘀证是冠心病最常见证型，气血阴阳失调是其基本病理变化。现代研究多集中在血液流变学、凝血功能、血管内皮功能损伤、炎性介质等方面［7］。尹克春［8］通过研究发现，冠心病病人循环血的单核细胞、中性粒细CD11b、CD18表达增加与冠心病血瘀证关系密切;冠心病患者的细胞免疫功能降低而体液免疫应答增强，并表现为易感染和慢性炎症过程，大量单核细胞黏附于血管内皮一样会增加血流力，可能是形成血瘀证的原因之一。PueeettiL［9］等研究认为，FVII升高致血液处于高凝状态、斑块破裂、局部强烈的凝血反应等因素都会引起血管堵塞。冠心病血瘀证与ACE基因多态性的相关性研究较少。毛以林等［10］研究结果显示，冠心病血瘀证组ACE基因型DD型及D等位基因频率比非血瘀证组和健康对照组高。张鹏［11］等研究显示，多支病变以痰瘀相兼、瘀血证、痰浊证为主。

本实验采用PCR方法对119例冠心病血瘀证患者血管狭窄数与ACE基因I/D多态性的相关性进行研究，结果表明，冠心病血瘀证患者ACE基因DD、I/D型，心脏多支血管可能存在病变。这也表明，冠心病血瘀证患者的严重程度与ACE基因DD型及I/D型呈正相关性，揭示了冠心病血瘀证血管病变支数与ACE基因多态性存在一定的关系。与王阶［12］等研究认为冠心病患者冠脉病变的支数、狭窄程度与血瘀证存在一定的关联结果一致。该结论对于临床有一定的指导意义，即ACE基因型的检测可以作为冠脉造影检测之前的一种筛查方式，如果检测ACE基因多态性示，DD、ID型时患者可能存在多支病变，对于这类患者可以进一步行冠状动脉造影检查。在本研究基础上，可继续探讨冠心病血瘀证积分与冠状动脉血管狭窄积分是否具有相关性等进行深入研究，血瘀证并不等同于西医学的某方面指标，是多基因、多系统共同作用的结果。因此，血瘀证与基因之间的相关性更需要广大医学工作者从基因组学、蛋白组学进行更深入的探索研究。

［1］HARRAP SB，TOURIO C CAMBIEN F，et al．The ACE Gene I/ D Polymorphism Is Not Associated With the Blood Pressure and Carsiovoscular Beniefits of ACE Inhibition Int J Hypertention，2003，42:297-303．

［2］NOMENCLATUREANDCRITERIAFORDIAGNOSISOF ISCHEMIC HEART DISEASE．Report of the Joint International Society and Federation of Cardiology/World Health Organization task force on standardization of clinical nomenclature［J］．Circul，1979，59(3):607-609．

［3］中国中西医结合学会活血化瘀研究专业委员会．血瘀证诊断标准［J］．中国中西医结合杂志，1987，7(3):129．

［4］RIGAT B，HUBERTC，ALHENC-GELASF，etal．An insertion/deletion PolymorPhism in the angiotensin I-coniverting enigne gene Accounting for habf the variance of serwn enzyme level［J］．Int Clin Invest，1990，86(4)134:3-6．

［5］DIAMANTOPOULOS EJ，ANDREADIS E，KAKOU M，et al．Arteriosclerosis of cartid arteries and the ace insertion/deletion polymorphism insubjects with diabetes mellitustype2［J］．Int Angiol，2002，21:63-69．

［6］RIERA-FOUTUNY，CREAL JT CHAVES FJ，et al．The relation between obesity，abdominal fat deposit and the angiotensionconverting enzyme gene I/D polymorphism and its association with coronary heart disease International Journal of Obesity，2005，29:78-84．

［7］洪永敦，黄衍寿，吴辉，等．冠状动脉粥样硬化性心脏病中医证候与炎症因子关系的临床研究［J］．广州中医药大学学报，2005，22(2):81-85．

［8］尹克春，曾星．冠心病血瘀证病人血白细胞CD11B/CD18表达的研究［J］．中西医结合心脑血管杂志，2003，1(7):381-383．

［9］PUEEETTI L，BRUNI F，BOVA G，et al．Role of platelets in Tissue factor expression by monocytes in normal and hypercholes terolemic subjects．In Vitro effect of cerivastatin［J］．Int J Clin Lab Res，2000，30(3):147-156．

［10］毛以林，袁肇凯，黄献平，等．冠心病血瘀证与血管紧张素转换酶基因多态性的相关性研究［J］．中国中西医结合杂志，2004，24(9):776．

［11］张鹏，刘鹏，徐伟建，等．368例冠心病冠脉病变特点与中医证型的相关性研究［J］．中西医结合心脑血管杂志，2010，8 (11):1308-1311．

［12］王阶，何庆勇，马长生，等．基于冠脉造影的冠状动脉粥样硬化性心脏病冠脉病变与血瘀证的相关性研究［J］．中国中西医结合杂志，2008，28(12):1074-1077．

The Association Research between Cardiovascular Disease Variables of the Blood Stasis Syndrome of Coronary Heart and ACE Gene Polymorphism

SONG Shu-xia1，LI Jian-jun2△，LIU Ying1，LUO You-wen1，HUANG Li-ying1
(1．Maternal and Child Care Service Center，Guangdong Province，Guangzhou 510000，China; 2．Sun Yi-xian Memorial Hospital of Zhongshan University，Guangzhou 510000，China)

objective:In order to discover The association between the blood stasis syndrome of coronary heart disease with cardiovascular disease variables and Angiotensin converting enzyme gene Polymorphism．Methods:To observe the distribution of ACE gene DD、DI、II and allele frequencies，we detect the angiotensin converting enzyme gene polymorphism of 119 cases in the group of syndrome of coronary heart disease with the method of PCR technology．Results:Cardiovascular disease variables of the cases with ACE gene DD DI are more than those with ACE gene II．Conclusion:The patients of Blood stasis syndrome of coronary heart disease carry ACE gene DD、DI are more seriously than those carry ACE II．

Coronary heart disease;Blood stasis syndrome;Vascular lesions;Angiotensin converting enzyme gene; Polymorphism

R541．4

B

1006-3250(2017)01-0090-03

2016-07-26

广东省科技计划课题(2008B030301074);广东省中医药局课题(1060167)

宋曙霞(1979-)，女，湖南人，主治医师，医学硕士，从事中西医结合临床与研究。

△通讯作者:李建军(1965-)，男，副主任医师，医学博士，硕士研究生导师，从事中西医结合心血管疾病的临床与实验研究，Tel:13922389869。