贵妃鸡与麒麟鸡微卫星遗传多样性研究

黄勋和，张金枫，陈洁波，李威娜，钟福生，杜炳旺

（1. 嘉应学院生命科学学院，广东梅州 514015；2. 广东海洋大学农学院，广东湛江 524088）

贵妃鸡与麒麟鸡微卫星遗传多样性研究

黄勋和1，张金枫1，陈洁波1，李威娜1，钟福生1，杜炳旺2*

（1. 嘉应学院生命科学学院，广东梅州 514015；2. 广东海洋大学农学院，广东湛江 524088）

以岭南黄鸡为参照，利用微卫星位点检测贵妃鸡和麒麟鸡的遗传多样性，评估群体遗传资源现状。结果表明：26个微卫星位点在30个贵妃鸡、40个麒麟鸡和30个岭南黄鸡个体中共检测到197个等位基因，每个位点的等位基因范围为3个（MCW0037、MCW0165、MCW0098）～19个（LEI0234），平均7.58；总体平均期望杂合度为0.6816，平均观察杂合度0.5625，平均多态信息含量0.6327；岭南黄鸡的遗传多样性最高，麒麟鸡次之，贵妃鸡最低；3个群体均偏离了哈迪-温伯格平衡；贵妃鸡和麒麟鸡的群体内近交系数高于岭南黄鸡，表明前者的近亲交配事件较频繁；麒麟鸡群体内的遗传分化系数（均值0.2433）和岭南黄鸡（0.2281）大于贵妃鸡（0.0359），表明后者的有效群体较小。在后续的品种选育工作中应当加强亲本亲缘关系的评估，提高选育群体的有效数量，尽量减少近亲交配。

微卫星；多态性；贵妃鸡；麒麟鸡；岭南黄鸡；近交

贵妃鸡（Princess Chicken），又称贵妇鸡，原产于法国，主要分布于法国、英国、荷兰等欧洲国家，是著名的观赏与肉用珍禽；21世纪初广东海洋大学家禽育种中心率先系统研究了贵妃鸡，培育出商用配套系，得到了广泛的推广。麒麟鸡（Frizzle Chicken）因羽毛向上翻卷而闻名，故又称翻毛鸡、卷毛鸡；卷羽有利于鸡体表的散热，适合热带或中国南方地区饲养，是原产于粤西地区的特色地方品种。贵妃鸡与麒麟鸡的研究主要集中在生物学基础特性[1-3]、品种选育[4-5]、生产与应用[6-7]等，在遗传多样性方面研究则较少[8-9]。

家禽遗传多样性的下降和侵蚀引起了人们广泛的关注。在许多品种的选育过程中，对父母代种群的选择往往只考虑外部形态及性状的整齐性，未考虑亲缘关系、遗传多样性与种群遗传结构等遗传背景。研究表明，近亲杂交可能会引起后代生存能力及生产性能的下降，不利于品种的保护与开发利用，从而降低经济效益。维持种内的遗传多样性，有助于物种和种群的自身繁殖能力和人工选择潜能。因此，评估品种的遗传多样性水平有助于品种的保种选育和生产应用[10]。

微卫星DNA分子标记具有共显性遗传、遗传稳定、高多态性、受进化选择压力小等特点，被广泛用于群体遗传多样性、遗传分化、基因交流和品种间混合等研究[11-12]。本研究以广东饲养广泛的商品鸡—岭南黄鸡为参考群体，应用微卫星位点研究贵妃鸡与麒麟鸡的遗传多样性，评估品种的遗传资源现状，为品种的保种选育与利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 30只贵妃鸡和40只麒麟鸡样品来源于广东海洋大学家禽育种中心，30只岭南黄鸡（Ⅲ号配套系）来源于广东农业科学研究院畜牧研究所，肱静脉取血，95%乙醇-81℃保存。基因组DNA采用试剂盒HiPure Tissue DNA Mini Kit（广州美基生物技术有限公司）提取，-20℃保存备用。

1.2 微卫星位点选择与PCR扩增 26对微卫星引物来自于世界粮农组织推荐的位点（表1），由广州艾基生物技术有限公司合成。正向或反向引物5'端加上荧光标记。多重PCR反应体系为10 μL，含5 μL Multiplex PCR MasterMix（北京康为世纪生物科技有限公司），引物0.1～0.4 μL（20 μmol/L），DNA模板 50～100 ng。扩增条件为94℃预变性4 min，然后30个循环（94℃变性30 s，58～60℃退火1 min，72℃延伸1 min），最后72℃延伸7 min。取2 μL PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测目标条带是否成功扩增。

表1 微卫星引物信息与退火温度

组合 序号 引物名称 引物序列（5'→3'） 退火温度,℃ 扩增片段, bp 23 MCW0078 F： CCACACGGAGAGGAGAAGGTCTⅥ135～148 R： TAGCATATGAGTGTACTGAGCTTC 24 MCW0067 F： GCACTACTGTGTGCTGCAGTTT 176～182 R： GAGATGTAGTTGCCACATTCCGAC 25 MCW0098 F： GGCTGCTTTGTGCTCTTCTCG 261～265 R： CGATGGTCGTAATTCTCACGT 26 MCW0330 F： TGGACCTCATCAGTCTGACAG 258～292 R： AATGTTCTCATAGAGTTCCTGC 60

1.3 基因分型 多重PCR产物经变性处理后在ABI PRISM 3730自动毛细管分析仪检测，由无锡翼和应用生物技术有限公司完成。LIZ500为内标，应用软件GeneMarker 2.2.0对电泳检测结果进行等位基因大小判读，并辅以人工校正。

1.4 统计分析 等位基因数(N)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(Polymorphic Information Content，PIC)由 Cervus 3.0.3执 行。F-statistics统计分析由GENETIX 4.05计算。

2 结果与分析

2.1 微卫星PCR结果与基因分型 多重PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，各个微卫星位点均能较均匀地扩增出来，并且清晰可辨，说明多重PCR扩增体系较为优化（图1A）。毛细管凝胶电泳荧光电泳检测结果也较为清晰，不同等位基因错落分布，能够准确读取等位基因大小（图1B、C）。

图1 多重图与基因分型图

2.2 群体遗传多样性 26个微卫星位点在贵妃鸡、麒麟鸡和岭南黄鸡共100个个体的检出成功率为99.88%，共检测到197个等位基因，每个位点的等位基因范围为3～19个，平均7.58。位点LEI0234的等位基因最多，为19个，其次是MCW0183，为17个，排在第3的是LEI0094和MCW0104，为15个，而位点MCW0037、MCW0165和MCW0098均只有3个等位基因。总体平均期望杂合度为0.6816，平均观察杂合度为0.5625，平均多态信息含量为0.6327。在3种鸡品种中，岭南黄鸡的遗传多样性最高，麒麟鸡次之，贵妃鸡最低，即平均等位基因数量、观察杂合度、期望杂合度和多态信息含量均按岭南黄鸡、麒麟鸡和贵妃鸡依次递减（表2）。在观察杂合度低于0.5的位点中，贵妃鸡有15个，麒麟鸡和岭南黄鸡各有4个。值得注意的是，贵妃鸡有2个位点（MCW0295和MCW067）杂合度为0。3个鸡群体均偏离了哈迪-温伯格平衡（P＜0.0001）。

2.3 群体间的遗传分化 群体间的遗传距离（Fst）分别为贵妃鸡—麒麟鸡（0.2411）、贵妃鸡—岭南黄鸡（0.2454）和麒麟鸡—岭南黄鸡（0.0362）。贵妃鸡和麒麟鸡的群体内近交系数（Fis）高于岭南黄鸡，但贵妃鸡的总近交系数要低于麒麟鸡和岭南黄鸡（表3）。麒麟鸡群体内的遗传分化系数（均值0.2433）和岭南黄鸡（0.2281）要高于贵妃鸡（0.0359）。

表2 基于26个微卫星位点的贵妃鸡、麒麟鸡与岭南黄鸡遗传多样性分析

3 讨 论

本研究利用26对微卫星位点比较分析了贵妃鸡、麒麟鸡和岭南黄鸡的遗传多样性。结果显示，3个鸡种群体的遗传多样性均较低，低于五华三黄鸡[13]等地方鸡。虽然研究样本数量差异对结果会有一定的影响，但本研究的3个品种样本量均在30份及以上，能够保证95%的等位基因被检出，可以较好地反映出检测群体的遗传多样性水平[14]。

进一步分析显示贵妃鸡和麒麟鸡的遗传多样性低于岭南黄鸡，尤其是贵妃鸡，He、Ho和PIC均远低于0.5。一般认为，PIC大于0.5，说明群体遗传多样性较高，反之则较低[15]。这可能与它们的选育历史有关。贵妃鸡最早由民间从国外零散引进饲养，然后广东海洋大学家禽育种中心收集后从有限的亲代个体开始选育[4]。线粒体D-loop研究也显示贵妃鸡的核苷酸多态度较低[8]，低于其他地方鸡，如黄郎鸡的0.01254[16]等。麒麟鸡是粤西地区有名的特色土鸡，饲养历史悠久，种群数量大。而岭南黄鸡是广东农业科学院畜牧研究所培育的黄羽肉鸡新品种，本研究样品来源于慢羽优质型品种（即Ⅲ号配套系），含惠阳胡须鸡和广西三黄鸡的血缘。惠阳胡须鸡和广西三黄鸡是华南地区优质地方鸡品种，遗传多样性水平较高[17-18]。此外，贵妃鸡与麒麟鸡和岭南黄鸡的遗传距离均大于麒麟鸡与岭南黄鸡，也从侧面说明了它们具有不同的选育历史。因为贵妃鸡是外来引进品种，而麒麟鸡和岭南黄鸡分布于广东地区，可能具有一定的亲缘关系。

表3 F-statistics统计分析结果

贵妃鸡和麒麟鸡的群体近交系数明显高于岭南黄鸡，说明前者种群内近亲交配事件较频繁；同时群体内的遗传分化系数低于岭南黄鸡，说明贵妃鸡和麒麟鸡的有效群体较小。因此，在后续的品种选育工作中应加强亲本亲缘关系的评估，提高选育群体的有效群体数量，同时尽量减少近亲交配。

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Genetic Diversity of Princess Chicken and Frizzle Chicken Inferred from Microsatellites

HUANG Xun-he1, ZHANG Jin-feng1, CHEN Jie-bo1, LI Wei-na1, ZHONG Fu-sheng1, DU Bing-wang2*
(1. School of Life Sciences, Jiaying University, Guangdong Meizhou 514015, China; 2. College of Agricultural, Guangdong Ocean University, Guangdong Zhanjiang 524088, China)

The aim of this study was to evaluate the genetic diversity and genetic resources status of Princess chicken and Frizzle chicken, using microsatellite loci and use of Lingnan chicken for inferred samples. A total of 197 alleles was detected from 30 Princess chicken, 40 Frizzle chicken and 30 Lingnan chicken in 26 microsatellite loci. The number of alleles per locus ranged from 3 (MCW0037, MCW0165 and MCW0098) to 19 (LEI0234), with an average of 7.58. The mean expected heterozygosity, observed heterozygosity and polymorphic information content were 0.6816, 0.5625 and 0.6327, respectively. Lingnan chicken had the highest levels of genetic diversity, Frizzle chicken had the second one and Princess chicken had the lowest one. All these three chicken populations were deviated from Hardy-Weinberg equilibrium. The inbreeding coefficient within population of Princess chicken and Frizzle chicken was higher than that in Lingnan chicken, suggesting that high inbreeding events in former breeds. The genetic divergence coefficient within population of Frizzle chicken (0.2433, mean value) and Lingnan chicken (0.2281, mean value) was higher than that in Princess chicken (0.0359, mean value), indicating that small e ff ective population size in latter breed. Our results suggested that evaluation of genetic relationship for breeding need to be reinforced in the future, as well as to increase the effective parental population and to decrease inbreeding as possible.

Microsatellite; Polymorphism; Princess chicken; Frizzle chicken; Lingnan chicken; Inbreeding

S831.2

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-02-030

2016-05-04；

2016-06-15

种广东省自然科学基金项目（2014A030307018）；嘉应学院“创新强校工程”项目（CQX019）；广东省科技计划项目(2015A020208020、2016A030303068)；国家科技基础条件平台-特种动物子平台建设（201520）；嘉应学院重点科技计划项目（2015KJM03）

黄勋和（1982-），男，广东河源人，博士，讲师，主要从事中国家鸡遗传多样性与进化研究，E-mail：hxh826@ jyu.edu.cn

* 通讯作者：杜炳旺，教授，主要从事家禽育种与生产研究，E-mail：dudu903@163.com